Express o g nica atrav s de ensaios com pcr quantitativo em tempo real
Sponsored Links
This presentation is the property of its rightful owner.
1 / 43

Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real PowerPoint PPT Presentation


  • 162 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real. Fernando Colbari do Amaral. Expressão. Expressão gênica. Comparação de diferentes sistemas gênicos Célula normal vs tumor Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos Função gênica específica

Download Presentation

Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real

Fernando Colbari do Amaral


Expressão


Expressão gênica


Comparação de diferentes sistemas gênicos

Célula normal vs tumor

Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos

Função gênica específica

Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células)

Controle vs tratado

Estudos de Expressão Gênica


Isolamento


Genes diferentes

Extração de RNA total

mRNA´s


Quantificação da expressão gênica


Métodos de quantificação da expressão gênica

  • Reação em Cadeia da Polimerase

    • RT-PCR semi-quantitativa

    • PCR em Tempo Real


Taq DNA Polimerase

PCR

Primers/Sondas

DNA dupla fita

dNTP


Síntese de cDNA


PCR – 1° ciclo

Desnaturação

Anelamento

Extensão


Amplificação


RT-PCR semi-quantitativa

Diluição seriada do cDNA

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...


cDNA em concentrações decrescentes

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

Amplificação na maior diluição corresponde a uma

maior quantidade de cópias do gene na amostra


PCR-quantitativo

  • Método usado para medir a quantidade inicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema Fluorescente

  • Validação da expressão gênica global

    • Microarray

    • SAGE


PCR-quantitativo - Eficiência

  • Preparo da reação (pipetas calibradas)

  • Qualidade do template (molde)

  • Desenho dos primers (dimers)

  • Condições de termociclagem

  • Concentração dos reagentes (MgCl2)

  • Tamanho do amplicon (50-150 bp)


Características

  • Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio

  • “Sistema aberto” que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham  compatível com os filtros disponíveis

  • Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão)

  • Filtros


Sistema de detecção


SYBR® Green

  • Intercalante de DNA dupla fita

  • Fluoróforo em suspensão

  • Inespecífico

  • Curva de dissociação ou melting

  • Não permite multiplex


Curva de dissociação

  • Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico

  • Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação

  • Realizada ao término da termociclagem


Sistema TaqMan®

  • Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease

  • Trabalha com sondas que contém fluoróforos

  • Específico

  • Permite Multiplex

  • Não necessita curva de dissociação

  • Sonda:

Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia


R

5’

3’

Q

R

Q

R

5’

3’

Q


R

Q

Q

R


Características da sonda

  • Localiza-se de 1 a 5 pb do primer

  • Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers

  • A primeira base não pode ser G (Quencher)

  • Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais

  • Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)


Uracil-N-Glicosilase

Desnaturação

Ativação da AmpliTaq Gold

Anelamento

e

Extensão

Condições de Amplificação

Condições Universais para desenho dos oligos:

- Amplicon de 50 a 100 pb

  • Conteúdo de GC

  • Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C

Condições Universais de Termociclagem:


Fase onde a intensidade de sinal de produto

amplificado ainda não ultrapassa a intensidade

da fluorescência encontrada no meio.

Terminologia

Baseline


Nível de fluorescência onde a reação é

detectada durante a fase exponencial; linha de

comparação entre as amostras

Terminologia

Threshold


Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza

o limiar de detecção (Threshold)

Terminologia

Cycle Threshold (CT)


Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva

(sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir

erros de pipetagem

Terminologia

Rn


Tipos de Quantificação

  • Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento

Músculo

Pele

Neurônio

+ +

+ + +

+ + +

+

+

+ +


Tipos de quantificação

  • Quantificação Absoluta

    • Determinação do número exato de moléculas.

      Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA.

  • Quantificação Relativa

    • Análise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador

      São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordens

      de grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).


Controle endógeno

  • Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S)

  • Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa

  • Corrigir a presença de inibidores

  • Corrigir diferenças na quantificação de RNA

  • Corrigir degradação de material (RNA)

  • Normalização dos resultados


  • Controle Endógeno ideal

  • Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise

  • Expressão em A = Expressão em B

    Expressão no Tratado

    Expressão no Controle

= ~1


Quantificação absoluta

Necessita de uma curva padrão


Quantificação absoluta

Cálculos com curva Standard

C-myc

GAPDH

C-mycN

_______________________________________________

C-myc Calibrador


Quantificação relativa

Cálculos sem curva Standard

Ct= Ct (alvo)- Ct (controle endógeno)

Ct= Ct (sample)- Ct (calibrador)

Quantidade Relativa = 2 -Ct


Ensaios customizados

  • Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações.

  • Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas

  • Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório

  • Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem


  • Custom TaqMan® Gene Expression

    - Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações.

  • TaqMan® Gene Expression Assays

    - Kit pronto disponível (genes conhecidos)

  • TaqMan® Endogenous Control

    - Kit pronto disponível


Considerações finais

  • Custo-benefício

  • Conhecimentos específicos

  • Validação de resultados

  • Interpretação estatística


  • Login