Express o g nica atrav s de ensaios com pcr quantitativo em tempo real
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Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real. Fernando Colbari do Amaral. Expressão. Expressão gênica. Comparação de diferentes sistemas gênicos Célula normal vs tumor Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos Função gênica específica

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Presentation Transcript
Express o g nica atrav s de ensaios com pcr quantitativo em tempo real
Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real

Fernando Colbari do Amaral


Expressão em Tempo Real


Expressão gênica em Tempo Real


Estudos de express o g nica

Comparação de diferentes sistemas gênicos em Tempo Real

Célula normal vs tumor

Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos

Função gênica específica

Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células)

Controle vs tratado

Estudos de Expressão Gênica


Isolamento em Tempo Real


Genes diferentes em Tempo Real

Extração de RNA total

mRNA´s



M todos de quantifica o da express o g nica
Métodos de quantificação da expressão gênica em Tempo Real

  • Reação em Cadeia da Polimerase

    • RT-PCR semi-quantitativa

    • PCR em Tempo Real


Taq em Tempo Real DNA Polimerase

PCR

Primers/Sondas

DNA dupla fita

dNTP


S ntese de cdna
Síntese de cDNA em Tempo Real


Pcr 1 ciclo
PCR – 1° ciclo em Tempo Real

Desnaturação

Anelamento

Extensão


Amplifica o
Amplificação em Tempo Real


Rt pcr semi quantitativa
RT-PCR semi-quantitativa em Tempo Real

Diluição seriada do cDNA

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...


cDNA em concentrações decrescentes em Tempo Real

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

Amplificação na maior diluição corresponde a uma

maior quantidade de cópias do gene na amostra


Pcr quantitativo
PCR-quantitativo em Tempo Real

  • Método usado para medir a quantidade inicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema Fluorescente

  • Validação da expressão gênica global

    • Microarray

    • SAGE


Pcr quantitativo efici ncia
PCR-quantitativo - Eficiência em Tempo Real

  • Preparo da reação (pipetas calibradas)

  • Qualidade do template (molde)

  • Desenho dos primers (dimers)

  • Condições de termociclagem

  • Concentração dos reagentes (MgCl2)

  • Tamanho do amplicon (50-150 bp)


Caracter sticas
Características em Tempo Real

  • Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio

  • “Sistema aberto” que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham  compatível com os filtros disponíveis

  • Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão)

  • Filtros


Sistema de detec o
Sistema de detecção em Tempo Real


Sybr green
SYBR em Tempo Real® Green

  • Intercalante de DNA dupla fita

  • Fluoróforo em suspensão

  • Inespecífico

  • Curva de dissociação ou melting

  • Não permite multiplex


Curva de dissociação em Tempo Real

  • Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico

  • Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação

  • Realizada ao término da termociclagem


Sistema taqman
Sistema TaqMan em Tempo Real®

  • Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease

  • Trabalha com sondas que contém fluoróforos

  • Específico

  • Permite Multiplex

  • Não necessita curva de dissociação

  • Sonda:

Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia


R em Tempo Real

5’

3’

Q

R

Q

R

5’

3’

Q


R em Tempo Real

Q

Q

R


Caracter sticas da sonda
Características da sonda em Tempo Real

  • Localiza-se de 1 a 5 pb do primer

  • Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers

  • A primeira base não pode ser G (Quencher)

  • Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais

  • Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)


Uracil-N-Glicosilase em Tempo Real

Desnaturação

Ativação da AmpliTaq Gold

Anelamento

e

Extensão

Condições de Amplificação

Condições Universais para desenho dos oligos:

- Amplicon de 50 a 100 pb

  • Conteúdo de GC

  • Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C

Condições Universais de Termociclagem:


Terminologia

Fase onde a intensidade de sinal de produto em Tempo Real

amplificado ainda não ultrapassa a intensidade

da fluorescência encontrada no meio.

Terminologia

Baseline


Terminologia1

Nível de fluorescência onde a reação é em Tempo Real

detectada durante a fase exponencial; linha de

comparação entre as amostras

Terminologia

Threshold


Terminologia2

Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza em Tempo Real

o limiar de detecção (Threshold)

Terminologia

Cycle Threshold (CT)


Terminologia3

Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva em Tempo Real

(sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir

erros de pipetagem

Terminologia

Rn


Tipos de quantifica o
Tipos de Quantificação em Tempo Real

  • Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento

Músculo

Pele

Neurônio

+ +

+ + +

+ + +

+

+

+ +


Tipos de quantifica o1
Tipos de quantificação em Tempo Real

  • Quantificação Absoluta

    • Determinação do número exato de moléculas.

      Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA.

  • Quantificação Relativa

    • Análise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador

      São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordens

      de grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).


Controle end geno
Controle endógeno em Tempo Real

  • Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S)

  • Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa

  • Corrigir a presença de inibidores

  • Corrigir diferenças na quantificação de RNA

  • Corrigir degradação de material (RNA)

  • Normalização dos resultados


  • Controle Endógeno ideal em Tempo Real

  • Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise

  • Expressão em A = Expressão em B

    Expressão no Tratado

    Expressão no Controle

= ~1


Quantifica o absoluta
Quantificação absoluta em Tempo Real

Necessita de uma curva padrão


Quantifica o absoluta1
Quantificação absoluta em Tempo Real

Cálculos com curva Standard

C-myc

GAPDH

C-mycN

_______________________________________________

C-myc Calibrador


Quantifica o relativa
Quantificação relativa em Tempo Real

Cálculos sem curva Standard

Ct= Ct (alvo)- Ct (controle endógeno)

Ct= Ct (sample)- Ct (calibrador)

Quantidade Relativa = 2 -Ct


Ensaios customizados
Ensaios customizados em Tempo Real

  • Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações.

  • Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas

  • Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório

  • Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem


  • Custom TaqMan® Gene Expression em Tempo Real

    - Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações.

  • TaqMan® Gene Expression Assays

    - Kit pronto disponível (genes conhecidos)

  • TaqMan® Endogenous Control

    - Kit pronto disponível


Considera es finais
Considerações finais em Tempo Real

  • Custo-benefício

  • Conhecimentos específicos

  • Validação de resultados

  • Interpretação estatística


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