express o g nica atrav s de ensaios com pcr quantitativo em tempo real
Download
Skip this Video
Download Presentation
Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 43

Express o g nica atrav s de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real - PowerPoint PPT Presentation


  • 209 Views
  • Uploaded on

Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real. Fernando Colbari do Amaral. Expressão. Expressão gênica. Comparação de diferentes sistemas gênicos Célula normal vs tumor Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos Função gênica específica

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Express o g nica atrav s de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real' - demetrius


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
express o g nica atrav s de ensaios com pcr quantitativo em tempo real
Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real

Fernando Colbari do Amaral

estudos de express o g nica
Comparação de diferentes sistemas gênicos

Célula normal vs tumor

Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos

Função gênica específica

Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células)

Controle vs tratado

Estudos de Expressão Gênica
slide6

Genes diferentes

Extração de RNA total

mRNA´s

m todos de quantifica o da express o g nica
Métodos de quantificação da expressão gênica
  • Reação em Cadeia da Polimerase
    • RT-PCR semi-quantitativa
    • PCR em Tempo Real
slide10

Taq DNA Polimerase

PCR

Primers/Sondas

DNA dupla fita

dNTP

pcr 1 ciclo
PCR – 1° ciclo

Desnaturação

Anelamento

Extensão

rt pcr semi quantitativa
RT-PCR semi-quantitativa

Diluição seriada do cDNA

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...

slide16

cDNA em concentrações decrescentes

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

Amplificação na maior diluição corresponde a uma

maior quantidade de cópias do gene na amostra

pcr quantitativo
PCR-quantitativo
  • Método usado para medir a quantidade inicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema Fluorescente
  • Validação da expressão gênica global
    • Microarray
    • SAGE
pcr quantitativo efici ncia
PCR-quantitativo - Eficiência
  • Preparo da reação (pipetas calibradas)
  • Qualidade do template (molde)
  • Desenho dos primers (dimers)
  • Condições de termociclagem
  • Concentração dos reagentes (MgCl2)
  • Tamanho do amplicon (50-150 bp)
caracter sticas
Características
  • Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio
  • “Sistema aberto” que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham  compatível com os filtros disponíveis
  • Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão)
  • Filtros
sybr green
SYBR® Green
  • Intercalante de DNA dupla fita
  • Fluoróforo em suspensão
  • Inespecífico
  • Curva de dissociação ou melting
  • Não permite multiplex
slide22

Curva de dissociação

  • Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico
  • Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação
  • Realizada ao término da termociclagem
sistema taqman
Sistema TaqMan®
  • Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease
  • Trabalha com sondas que contém fluoróforos
  • Específico
  • Permite Multiplex
  • Não necessita curva de dissociação
  • Sonda:

Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia

slide24

R

5’

3’

Q

R

Q

R

5’

3’

Q

slide25

R

Q

Q

R

caracter sticas da sonda
Características da sonda
  • Localiza-se de 1 a 5 pb do primer
  • Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers
  • A primeira base não pode ser G (Quencher)
  • Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais
  • Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)
slide27

Uracil-N-Glicosilase

Desnaturação

Ativação da AmpliTaq Gold

Anelamento

e

Extensão

Condições de Amplificação

Condições Universais para desenho dos oligos:

- Amplicon de 50 a 100 pb

  • Conteúdo de GC
  • Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C

Condições Universais de Termociclagem:

terminologia

Fase onde a intensidade de sinal de produto

amplificado ainda não ultrapassa a intensidade

da fluorescência encontrada no meio.

Terminologia

Baseline

terminologia1

Nível de fluorescência onde a reação é

detectada durante a fase exponencial; linha de

comparação entre as amostras

Terminologia

Threshold

terminologia2

Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza

o limiar de detecção (Threshold)

Terminologia

Cycle Threshold (CT)

terminologia3

Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva

(sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir

erros de pipetagem

Terminologia

Rn

tipos de quantifica o
Tipos de Quantificação
  • Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento

Músculo

Pele

Neurônio

+ +

+ + +

+ + +

+

+

+ +

tipos de quantifica o1
Tipos de quantificação
  • Quantificação Absoluta
    • Determinação do número exato de moléculas.

Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA.

  • Quantificação Relativa
    • Análise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador

São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordens

de grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).

controle end geno
Controle endógeno
  • Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S)
  • Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa
  • Corrigir a presença de inibidores
  • Corrigir diferenças na quantificação de RNA
  • Corrigir degradação de material (RNA)
  • Normalização dos resultados
slide36

Controle Endógeno ideal

  • Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise
  • Expressão em A = Expressão em B

Expressão no Tratado

Expressão no Controle

= ~1

quantifica o absoluta
Quantificação absoluta

Necessita de uma curva padrão

quantifica o absoluta1
Quantificação absoluta

Cálculos com curva Standard

C-myc

GAPDH

C-mycN

_______________________________________________

C-myc Calibrador

quantifica o relativa
Quantificação relativa

Cálculos sem curva Standard

Ct= Ct (alvo)- Ct (controle endógeno)

Ct= Ct (sample)- Ct (calibrador)

Quantidade Relativa = 2 -Ct

ensaios customizados
Ensaios customizados
  • Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações.
  • Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas
  • Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório
  • Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem
slide41
Custom TaqMan® Gene Expression

- Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações.

  • TaqMan® Gene Expression Assays

- Kit pronto disponível (genes conhecidos)

  • TaqMan® Endogenous Control

- Kit pronto disponível

considera es finais
Considerações finais
  • Custo-benefício
  • Conhecimentos específicos
  • Validação de resultados
  • Interpretação estatística
ad