El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular
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El diagnóstico de tuberculosis utilizando técnicas de biología molecular. Beatriz López Servicio Micobacterias Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Carlos G. Malbran”. Estudia las macromoléculas (ADN, ARN, enzimas, hormonas). Linus Carl Pauling (1930). Watson y Crick (1953).

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El diagnóstico de tuberculosis utilizando técnicas de biología molecular

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Presentation Transcript


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

El diagnóstico de tuberculosis utilizando técnicas de biología molecular

Beatriz LópezServicio MicobacteriasInstituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Carlos G. Malbran”


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Estudia las macromoléculas (ADN, ARN, enzimas, hormonas)

Linus Carl Pauling (1930)

Watson y Crick(1953)

Frederic Sangery Walter Gilbert(1977)

Kary Mullis(1986)


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Aportes al manejo de las enfermedades infecciosas

Secuencias especie-específicas

  • Detección de un gérmen patógeno en la muestra o en cultivo

Secuencias y elementos móviles que generan variabilidad

  • Detección de aislamientos idénticos

  • Detección de resistencia a drogas

Mutaciones

  • Prevención

  • Tratamiento

Genes


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Cuales son aplicaciones útiles y factibles para el manejo de la tuberculosis


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Dependiendo del escenario donde se trabaja

Situación epidemiológica de tuberculosis

Población a investigar

Infraestructura (edilicia, bioseguridad)

Logística (transporte y telecomunicación)

Recursos (humanos y presupuesto)


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Uruguay

2011

Prevalencia baja 21 /100000 hab

Actividades recomendadas

-Diagnóstico de situación

-Incorporación de métodos para

incrementar la confirmación del diagnóstico de tuberculosis

-Incorporación de métodos para el diagnóstico de TB latente

-Incorporación de métodos para optimizar la vigilancia epidemiológica


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

2011

817 casos

94% casos pulmonares (57% B+)

13% HIV +

Examen microscópico

en el día

Diagnóstico de TBC

Sensibilidad limitada a 5000 a 10000 bacilos /ml


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evidencia sólo 10 a 100 BAAR presentes en una muestra

Cultivo

Económicos caros

Lentos rápidos

Disminuir a la mitad el tiempo de detección del cultivo positivo

(7 a 30 días para líquidos y 15–60 días para sólidos)


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMTD)

BD-ProbeTec (SDA) test

Roche COBAS Amplicor MTB

Abbott LCx test

Neested PCR

PCR

1986

2000

1 ciclo

2 ciclos

3 ciclos

mitad de ciclos

último ciclo

Amplificación de ácidos nucleicos

Amplificación


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMTD)

BD-ProbeTec (SDA) test

Roche COBAS Amplicor MTB

Abbott LCx test

Real time PCR

Neested PCR

PCR

1986

2001

Amplificación de ácidos nucleicos


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Meta-análisis en muestras respiratorias (125 estudios utilizando equipos comerciales)

El uso de diferentes puntos de corte y de otras muestras que no son esputo podrían explicar la heterogeneidad de resultados

Basados en estas observaciones, el uso de los métodos de amplificación no pueden reemplazar a los métodos convencionales para el diagnóstico de TBC pulmonar

Ling DI, et al PLoS ONE 3: e1536, 2008


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Valoración del método de amplificación de ácidos nucleicos en una zona urbana de moderada prevalencia entre 2000 -2004

Sensibilidad: 92,5% (1337/1445)

Especificidad: 97,3% (940/966)

Laraque F.et al. Clin Infect Dis 49:46, 2009


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Valoración del método de amplificación de ácidos nucleicos en una zona urbana de moderada prevalencia entre 2000 -2004

Sensibilidad: 92,5% (1337/1445)

94,3%(1262/1339)

70,7%(75/106)

Los resultados están en línea con la bibliografía y con las nuevas recomendaciones del CDC y apoyan el uso de las pruebas de amplificación para un mejor manejo del paciente

Laraque F.et al. Clin Infect Dis 49:46, 2009


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Meta-análisis en muestras no respiratorias

Muestras de liquido cefalorraquídeo (50 estudios)

56 (46-66)

98(97-99)

No determinada

Pai M, et al. Lancet Infect Dis 3:633, 2003


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Meta-análisis en muestras no respiratorias

Muestras de liquido pleural

(40 estudios) n:1996 muestras

Pai M.,et al BMC Infectious Diseases 4:6, 2004


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Recomendaciones del uso de métodos de amplificación

CDC. MMWR 58(01);7-102009

Interpretar resultados de AAN correlacionando con el resultado de la baciloscopia

Muestras respiratorias B+ AAN + se presume TBC

Muestras respiratorias B-

  • Pacientes

  • vírgenes de tratamiento

  • con imagen de patología pulmonar

  • para quienes no se ha decidido instaurar tratamiento anti-TBC

Si resulta positiva en una muestra respiratoria con baciloscopia negativa, el resultado debe ser confirmado con otra PCR realizada otro día, con otra muestra del paciente, para descartar contaminación de laboratorio

El resultado negativo no descarta tuberculosis


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Los organismos de regulación de países industrializados aun no han aprobado la aplicación de equipos diagnósticos que amplifican ácidos nucleicos para investigar tuberculosis extrapulmonar


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Amplificación de ácidos nucleicos

Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMTD)

Roche COBAS Amplicor MTB

BD-ProbeTec (SDA) test

Cepheid Xpert MTB test

Abbott LCx test

Real time PCR

TRCRapid M.TB

PCR

Neested PCR

LAMP

1986

2006

2009

2001


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

6 cebadores

FIT cebador interno de avance

BIP cebador interno reverso

F3 y B3 cebadores externos

FLP BLP cebadores de lazo

Bst polymerase fragment

Buffers de mezcla

dntps

63 ºC 60 minutos

En papel de aluminio SYBR Green I (Invitrogen)

Centrifuga después de la reacción

LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)

calcein, manganese chloride,Hydroxy naphthol blue

Ming Hong, et al. World J Microbiol Biotechnol (2012) 28:523–531


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Mitarai S, et al, 2011

CMT

SP,SC

LAMP test Kit

Bst

67ªC

Real -Time turbidimetry and fluorencense

40 min

Geojith G, et al, 2011

MT,MB

SP

rimM

Bst

65ªC

SYBR Geen I

120 min

Khushboo J, et al, 2011

CMT

CSF

IS6110

Bst

63ªC

Real -Time turbidimetry

60 min

Aixiao Bi, et al., 2012

MT,MB,MA,MM

SC

hspX

Bst

67ªC

Real -Time turbidimetry

27 min

10 copies

Ming Hong, et al, 2012

MT,MB

SP,SC

Esat6/ mtp40

Bst

67ªC

Calein, MnCl2, hydroxy naphthol blue, SYBR Green I

45 min

25 copies

MT: M. tuberculosis; MB: M. bovis; MA: M. africanum; MM: M. microti; CMT:Complejo M tuberculosis, ; SP: sputum; SC: solid culture; CSF: cerebrospinal fluid


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evaluación del equipo LAMP para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Sensibilidad 84%

Especificidad 96%

Prevalencia 5%

LAMP

VPP : 42 / 83 *100 : 50%

VPN : 912 / 920 *100 : 99,1%


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evaluación del método LAMP para el diagnóstico de meningitis tuberculosa

Khushboo J. Nagdev, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 1861–1865


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Ventajas

  • Rápida amplificación de DNA utilizando condiciones isotérmicas

  • No requiere equipamiento

  • Simple, sencillo

  • Alta sensibilidad en menor tiempo por el uso de cebadores de lazo

  • Sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación por amplicones

pero….

Todavía debe ser mejorado el sistema para mejorar la especificidad

Evaluado en otros escenarios


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA)

Cepheid Xpert MTB test

1-Licuefacción e inactivación del esputo

4- Filtración y lavado automático de la muestra

5- Lisis por ultrasonido y extracción del DNA

6- Mezcla de DNA con reactivos de PCR desecados

7- PCR hemi-nested con cuantificación fluorescente (PCR tiempo real)

2- Carga de 2 ml de muestra en el cartucho

3- Introducciòn del cartucho dentro del aparato


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA)

http://www.jove.com/video/3547/diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Único proceso manual

Muestra decontaminada

Con solución

NaOH- y isopropanol

15 minutos

Disminuye en 6-8 logs la viabilidad


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Cámaras con soluciones y reactivos liofilizados

siringe

Válvula rotatoria y reactivos para purificación de ADN o ARN

Tubo de PCR

Émbolo( jeringa)

Raja et al.: Clinical Testing. Clinical Chemistry 51, 5, 2005


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

95% de cepas resistentes a R tienen mutaciones en esta región

PCR semi-anidada


Tratamiento estandarizado de tuberculosis

TRATAMIENTO ESTANDARIZADO DE TUBERCULOSIS

La resistencia a estas drogas define la multiresistencia

meses

2HRZ+E ó S

4HR

DROGAS DE PRIMERA LÍNEA

isoniacida

rifampicina

pirazinamida

etambutol

estreptomicina


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

MORTALIDAD

FRACASO

MULTIRRESISTENCIA

3,7

15,4

OTRAS RESISTENCIAS

  • Cualquiera

1,0

3,3

  • Cualquiera que incluya R

0,7

5,5

  • A una droga

Rifampicina

0,5

5,5

Isoniacida

1,5

2,2

Estreptomicina

1,3

2,3

Etambutol

2,1

0

RESULTADO DEL TRATAMIENTO DE TUBERCULOSIS

Corea, Perú, Hong Kong, Ivanovo, República Dominicana, Italia

n=5526 casos nuevos

RIESGO RELATIVO (Mantel-Haenszel)

DE

Espinal MA et al. JAMA 283: 2537-45. 2000


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

95% de cepas resistentes a R tienen mutaciones en esta región

Bacilos sin mutaciones

PCR semi-anidada


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

2 horas

la hibridación emite señal fluorescente captada y evidenciada automáticamente y en tiempo real mediante un sensor y un software que dibuja en una curva la señal cuantificada mostrando el progreso de la reacción


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

M tuberculosis resistente a R

al menos una sonda de rpoB no hibrida o si la hibridación entre la 1ª y última de las 5 sondas tiene retraso

(hay mutaciones que impiden la hibridación, otras la retardan )


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Sistema de PCR en tiempo real cerrado

  • Ventajasoperativas

  • Primera vez que un test con mayor sensibilidad que la baciloscopía

  • puede ser aplicado y descentralizado con mayor facilidad que el cultivo

  • no es necesario juntar muestras para mejorar la operatividad o bajar costos

genera riesgo biológico similar al generado por la baciloscopía minimiza el tiempo de procesamiento

y el riesgo de contaminación cruzada de laboratorio

Emplea iguales principios que sistemas comerciales anteriores, pero en un contenedor cerrado y con proceso automatizado


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en adultos

n

%

(IC 95%)

1770/1811

97,7

Sensibilidad

BK+

(97,1-98,4)

72,9

BK-C+

759/1041

(70,2-75,6)

99,2

Especificidad

10740/10823

(99,1-99,4)

13675

Kim SY, et alInt. J Tuberc Lung Dis 2012 ,11:1471-6

Dorman SE, et al. PLoS ONE 2012 ,7:e 43307

Corea del Sur Sudafrica

17 publicaciones, 17 países 1 muestra / paciente


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evaluación del sistema GeneXpert con muestras pulmonares

Investigando 2 y 3 muestras la sensibilidad entre casos BK se incrementa a 85% y 90%

La especificidad no está afectada por la presencia de micobacterias ambientales en las muestras


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evaluación del sistema Xpert MTB Rif para el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif para detectar la resistencia a rifampicina


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Xpert MTB/RIF plataforma multiple.

Otras aplicaciones

Xpert SA Nasal                                           

Staphilococcus aureus meticilino resistente

Xpert EV                                            

Enterovirus (meningitis)

Xpert C. difficile

Detection of Clostridium difficile

Xpert vanA                                  

Enterococcus vancomicina resistente

Clostridium difficile

Flu A, Flu B, and 2009 H1N1

Marcadores oncológicos

Se espera prueba para HIV en diciembre 2013


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Costo Xpert/MTB Rif

  • Para que sea viable y sostenible

  • se debecalcular no sólo el costo de los equipos y cartuchos

  • sinotambien de

  • Fuentes suplementarias de energia (donde los cortes son frecuentes)

  • Acondicionamiento de la temperatura (siesmuyalta)

  • La gestión de calidad

    • entrenamiento, validación en el país, evaluacionesexternasperiodicas

    • (no sustituiblepor la experienciainternacionalnipor la disponibilidad de controlesinternos)

  • Manejo y mantenimiento de stock en buenascondiciones

  • Calibracion y mantenimiento

  • Desecho de grandesvolumenes de insumosplásticos(cartuchos)


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Recomendaciones de utilización del Xpert-MTB/Rif®

en condiciones de programa en Latinoamérica

http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2011/Implantacion_Xpert-MTB-Rif_AMRO_Guatemala.pdf


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Consenso Laboratorios Supranacionales, Centros Colaboradores de OMS y Laboratorios de Referencia Nacional de países priorizados de las Américas para la aplicación costo-efectiva del sistema GenXpert MTB/RIF

El sistema debería ser empleado como primera prueba de diagnóstico en los siguientes dos grupos de pacientes

SR o caso con TB pulmonar con alto riesgo de TB-MDR (todo previamente tratado, contactos de MDR, positivos al 2do mes y otros grupos de riesgo reconocidos por el país)

SR VIH positivos

Complementada con baciloscopia y cultivo


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

La baciloscopia permite monitorear el tratamiento rápida y económicamente

  • El cultivo sigue siendo necesario para

  • confirmar el diagnóstico de 30% adicional de casos BK-

  • detectar resistencia a R originada por mutaciones no investigadas por los sistemas moleculares comerciales y validar resultados dudosos

  • investigar sensibilidad a otras drogas de primera y segunda línea


El diagn stico de tuberculosis utilizando t cnicas de biolog a molecular

Los métodos moleculares aplicados al diagnóstico rápido de tuberculosis

no reemplazan a la baciloscopia para detectar casos avanzados en escenarios con alta prevalencia y limitados recursos porque son mas caros

no reemplazan al cultivo para la detección de casos poco avanzados o formas extrapulmonares porque son menos sensibles

parecen ser muy precisos para el diagnóstico de tuberculosis y detección de resistencia a rifampicina


Muchas gracias

Muchas gracias


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