Instrumentālās metodes

1. Instrumentālās metodes • Kura mērķis - iepazīstināt studentus ar dažādām instrumentālām metodēm ar pielietojumu molekulārajā un šūnu bioloģijā, bioķīmijā un citās radniecīgās nozarēs • Kurss notiks LU BF un Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā (BMC)

2. Instrumentālo metožu kursa saturs • Proteīnu ekspresija, attīrīšana un elektroforēze (BF, 2xlekc., lab. d.) • Mikroskopija - optiskā (BF), konfokālā (BF), elektronu (BMC), lekc., lab.d., demonstr. • Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā (BF, lekc.+lab.d) • DNS sekvenēšana (BMC, lekc. +mini-lab.d.) • Masspektrometrija (BMC, lekc. + mini-lab.d.) • Reālā laika PCR (BMC, lekc. + mini-lab.d.) • Plūsmas citometrija (BMC, lekc. + demonstr.) • Radioaktīvo elementu pielietojums bioloģijā (BF, BMC, lekc. + demonstr.) • Proteīnu struktūru noteikšanas metodes – rentgenstruktūranalīze un KMR (BMC, BF 2xlekc., 1xmini lab.d.)

3. Prasības • Sekmīgi nokārtoti visi pārbaudes darbiņi • Apmeklēti visi laboratorijas darbi, par kuriem vēlāk iesniegti protokoli • Sekmīgi nokārtots gala tests • Kavētos pārbaudes darbiņus var uzrakstīt pēc lekcijas 331. telpā vai pēc nodarbībām BMC • Sekmīgi nokārtoto pārbaudes darbiņu pārlikšana nolūkā iegūt augstāku atzīmi netiks atbalstīta • Galīgā atzīme ir aptuveni proporcionāla nodarbību skaitam un tiks izlikta pēc formulas (1x atzīme pirmajā testā + 2x atzīme pie Tūra Selgas + 3x atzīme noslēguma testā)/6. Atzīme pie Tūra Selgas tiek izlikta par mikroskopijas/konfokālās mikroskopijas nodarbībām.

4. Proteīnu ekspresija un attīrīšana

5. Kā iegūt proteīnu? • No dabīgā organisma • Mākslīgi producēt citā organismā • Sintezēt (parasti tikai relatīvi īsus peptīdus!)

6. Proteīna iegūšana no dabīgā organisma • Priekšrocības: • 1. Nav nepieciešamības veikt ģenētiskas manipulācijas • 2. Proteīns vienmēr ir dabīgajā formā • Trūkumi • 1. Var būt grūti iegūt lielus daudzumus • 2. Var būt ētiskas problēmas • 3. Parasti grūti attīrīt • 4. Ierobežotas iespējas pētīt modificētus proteīnus

7. Piemērs: Liellopu seruma albumīns (BSA) • Asins serums satur ap 60% albumīna • Viegli izolējams ar precipitēšanas metodi • Liellopu asins serums ir plaši pieejams • BSA plaši pielieto molekulārajā bioloģijā

8. Proteīnu producēšana (“ekspresija”) citā organismā • Priekšrocības -Var uzproducēt praktiski jebkuru proteīnu -Dabā reti sastopamus proteīnus var uzproducēt lielos daudzumos -Proteīnu var modificēt, lai atvieglotu tā attīrīšanu -Var vikt citas ģenētiskas modifikācijas • Trūkumi -Nepieciešams veikt laikietilpīgas manipulācijas ar rekombinanto DNS -Proteīns var nebūt dabīgajā konformācijā vai izrādīties nešķīstošs

9. Vektori • Lai gēnu ievietotu citā organismā, lieto t.s. vektorus • Vektori ir divu veidu: • 1. Plazmīdu vektori (vairumā gadījumu) • 2. Vīrusu vektori

10. Plazmīdas • Cirkulāras ārpushromosomu DNS sekvences (pārsvarā baktērijās) • Plazmīdas parasti satur kādu gēnu, kas baktērijai palīdz izdzīvot neordināros apstākļos – piemēram antibiotiku klātbūtnē • Plazmīdās var ievietot svešas DNS sekvences • Ja svešā DNS sekvence ir zem promotera, šūna sāk ražot atbilstošo proteīnu

11. Promoters Replikācijas oriģins Intersējošais gēns Antibiotikas rezistences gēns

12. Proteīnu producēšana citā organismā • Proteīna gēnu ievieto vektorā (plazmīdā vai vīrusā) • Vektoru transformē izvēlētajās saimniekšūnās • Saimniekšūnas sāk producēt proteīnu Plazmīda Šūna

13. Vīrusu vektori • Var būt bakteriāli (bakteriofāgi), insektu, dzīvnieku vai augu • Parasti nebūtisku vīrusa gēnu aizvieto ar interesējošā proteīna gēnu • Šūnas inficē ar rekombinanto vīrusu • Vīrusa proteīni kopā ar interesējošo proteīnu tiek producēti saimniekšūnā

14. Piemērs: Bakulovīruss • Insektu vīruss • Inficē gan pašus insektus, gan arī kultivētas insektu šūnas • Polihedrīns ir proteīns, kas ietver vairākas vīrusa daļiņas • Polihedrīns palīdz vīrusam izdzīvot apkārtējā vidē • Laboratorijas apstākļos polihedrīns nav būtisks un to var aizvietot

16. Dažādas sistēmas: Bakteriālā Raugu Insektu Zīdītāju Augu Saimniekšūnu izvēle

17. Saimniekšūna var ietekmēt : • Produkcijas daudzumu • Šķīdību • Aminoskābju pēctranslācijas modifikācijas (glikozilēšanu, fosforilēšanu, etc)

18. Saimniekšūnas izvēlas atkarībā no: • Pielietošanas mērķa • Nepieciešamā proteīna daudzuma • Proteīna oriģinālā organisma • Cenas • Proteīna potenciālā toksiskuma • Sistēmas vienkāršības

19. Baktērijas > Raugi >> Insekti > Zīdītāji Kristalogrāfijai vai NMR ir nepieciešams ļoti daudz proteīna Šī iemesla pēc ne-bakteriālās sistēmas bieži ir nereālistiskas proteīnu strukturālajiem pētījumiem Saimniekšūnas izvēle atkarībā no nepieciešamā proteīna daudzuma

20. Produkcija baktērijās (E.coli) • Labās ziņas: • Produkcijas apjoms ir augsts • Lēti • Viekārši strādāt • Baktērijas ātri aug • Sliktās ziņas: • Proteīns bieži ir nešķīstošs • Nav pēctranslācijas modifikāciju • Ne-baktēriju membrānu proteīnus parasti nav iespējams producēt

21. Raugi • Labi: • Produkcijas apjoms ir augsts • Lēti • Samērā vienkārši strādāt (salīdzinot ar zīdītāju šūnām ) • Dažas pēctranslācijas modifikācijas ir līdzīgas zīdītāju šūnām • Slikti: • Ne visas pēctranslācijas modifikācijas ir tādas pašas kā zīdītāju šūnām • Proteīni bieži tiek pārglikolizēti

22. Insektu (Bakulovīrusa) sistēma • Interesējošā proteīna gēnu ievieto bakulovīrusa genomā • Insekta šūnu kultūru vai kāpurus inficē ar rekombinanto bakulovīrusu

23. Insektu (Bakulovīrusa) sistēma • Labi: • Produkcijas apjoms ir salīdzinoši augsts • Lētāk nekā zīdītāju šūnās • Lielākā daļa pēctranslācijas modifikāciju ir tādas pašas kā zīdītāju šūnās • Slikti: • Rekombinanta bakulovīrusa konstruēšana ir samērā sarežģīta • Daudz dārgāk nekā baktērijās vai raugos

24. Zīdītāju šūnas • Parasti izmanto transformētas zīdītāju šūnu kultūras • Visbiežāk COS šūnas (oriģināli no Āfrikas zaļajiem pērtiķiem) vai HEK šūnas (human embryonic kidney) • Šūnas transfecē ar plazmīdām vai inficē ar rekombinantajiem vīrusiem

25. Zīdītāju šūnas • Labi: • Zīdītāju proteīniem ir autentiskas pēctranslācijas modifikācijas • Proteīni ir šķīstoši • Slikti: • Produkcijas apjoms ir zems • Sarežģīti strādāt • Šūnas aug lēni • Ļoti dārgi

26. E.coli un zīdītāju šūnu audzēšanas salīdzinājums

27. Kā proteīnus dabūt ārā no šūnām ? • Iekššūnas proteīni : šūnu sagraušana • Sekretējamie proteīni – proteīni ir jau sekretēti no šūnām, bet tos nepieciešams koncentrēt • Vairumā gadījumu ir jāstrādā ar iekššūnas proteīniem

28. Šūnu sagraušana Fizikālās metodes • Ultraskaņa • Frenča prese • Lodīšu dzirnavas Ķīmiskās un fizioķīmiskās metodes • Deterģenti • Enzīmi (lizocīms baktēriju šūnām) • Osmotiskais šoks

29. Proteīnu iekoncentrēšna • Precipitēšana (ar amonija sulfātu vai polietilēnglikolu) • Ūdens ietvaicēšana vakuumā (jāņem vērā, ka pieaug sāļu koncentrācija) • Ultrafiltrācija

30. Šķīstošs vai nē? • Šķīstošs – viss kārtībā! • Nešķīstošs (ieslēguma ķermeņi): nav labi :( • Var izmēģināt refoldingu • Kā mēģināt uzlabot šķīdību: Samazinātekspresijas apjomu, pazemināt šūnu audzēšanas temperatūru • Nekas nepalīdz? • Izmēģināt citu saimniekšūnu veidu • Pamest projektu...

31. Bezšūnu proteīnu sintēze • Translāciju ir iespējams veikt in vitro • Daudz sarežģītāks process, nekā, piemēram, in vitro replikācija vai transkripcija • Nepieciešamas ribosomas, aminoskābes, tRNS, mRNS, aminoacil-tRNA sintetāzes, translācijas faktori,... • Izmanto šūnu lizātus • Var izmantot gan eikariotisko, gan prokariotisko šūnu lizātus • Parasti izmanto trušu retiklocītu, kviešu dīgļu šūnu vai E. coli lizātus

32. Bezšūnu proteīnu sintēze • Pielietojumi: • Šūnām toksisku proteīnu sintēze • Proteīnu iezīmēšana NMR • Membrānu proteīnu sintēze • Trūkumi: • Ļoti dārga metode • Grūti optimizējama metode

33. Proteīnu attīrīšana • Kāpēc? • Lai proteīnu raksturotu (enzimātiskā aktivitāte, ligandu piesaistīšana, stabilitāte, etc) • Lai noteiktu proteīna 3D struktūru • Lai identificētu proteīnu, saistītu ar noteiktu aktivitāti • Lai zinātniskiem, industriāliem vai medicīniskiem mērķiem saražotu proteīnu ar zināmu aktivitāti

34. Proteīnu attīrīšana pamatojas uz: • Molekulas izmēru • Virsmas lādiņu • Virsmas hidrofobitāti • Afinitāti (spēju piesaistīt citus savienojumus)

35. Proteīnu attīrīšanai visbiežāk izmanto kolonnu šķidruma hromatogrāfiju Proteīnu maisījumu laiž caur kolonnu, piepildītu ar gelveidīgu matricu ar noteiktām īpašībām Procesa gaitā proteīni viens no otra atdalās Proteīnu hromatogrāfija Kolonna Sūknis UV detektors Frakciju kolektors Proteīnu maisījums

36. Hromatogramma UV280 vienības 0.8 UV absorbcija (proporcionāla proteīnu koncentrācijai) 0.6 0.4 0.2 1 2 3 4 5 6 7 Frakcijas (tilpums, laiks...)

37. Kolonnas matricu materiāli - dekstrāni (sazaroti glikozes polimēri) - agaroze (galaktozes polimēri) - poliakrilamīds • jaukti agarozes – poliakrilamīda polimēri • pie saharīdu hidroksilgrupām var piešūt citas funkcionālās grupas, tādejādi mainot matricas īpašības

38. Dekstrāns Agaroze • pie saharīdu hidroksilgrupām var pievienot citas funkcionālās grupas, tādejādi mainot matricas īpašības

39. Poliakrilamīds

40. Kolonnas matricu veidi (pēc īpašībām) • Gēlfiltrācijas (atdala pēc molekulu izmēra) • Jonapmaiņas (atdala pēc molekulu lādiņa) • Hidrofobās (atdala pēc molekulu šķīdības) • Afinitātes (atdala pēc noteiktu proteīnu spējas piesaistīties citām molekulām)

41. Lieluma izslēgšanas hromatogrāfija (gēlfiltrācija) • Kolonnu piepilda ar matricu, kurā ir noteikta diametra kanāli vai iedobumi • Mazās molekulas iekļūst kanālos un tiek uz laiku aizkavētas • Vidējas molekulas retāk iekļūst kanālos un tādejādi kustas ātrāk • Lielās molekulas kanālos neiekļūst un kustas visātrāk

42. Lieluma izslēgšanas hromatogrāfija (gēlfiltrācija) • No matricas materiāla veido lodītes ar noteiktu poru diametru • Atšķirīgi poru (kanālu) diametri ir piemēroti dažādu lielumu molekulu attīrīšanai

43. Jonapmaiņas hromatogrāfija • Matrica (parasti agaroze) satur lādētas ķīmiskas grupas • Proteīni uz kolonnas sadalās atkarībā no to virsmas lādiņa

44. Jonapmaiņas hromatogrāfija • Katjonapmaiņa: Matrica ir negatīvi lādēta piemēram S (Sulfo) un CM (Carboxymethyl) • Anjonapmaiņa Matrica ir pozitīvi lādēta, piem. Q (Quaternary ammonium) un DEAE (Diethylaminoethyl) • Eluēšana: Ar lineāri pieaugošu sāls gradientu, pamatojas uz konkurējošiem joniem • Lielākā daļa proteīnu ir negatīvi lādēti, tāpēc parasti izmanto anjonapmaiņu

45. Jonapmaiņas hromatogrammas piemērs

46. Hidrofobā hromatogrāfija • Pamatojas uz hidrofobajām mijiedarbībām • Kolonnas matrica satur hidrofobas grupas (fenil-, butil-, oktil-, u.c.) • Proteīnu hidrofobās aminoskābes mijiedarojas ar matriksa hidrofobajām grupām • Hidrofili proteīni kolonnā kustas ātrāk • Proteīnus uz kolonnas var adsorbēt augstā sāls koncentrācijā • Proteīnus pakāpeniski eluē ar samazinošos sāls koncentrācijas gradientu

47. Afinitātes hromatogrāfija • Pie matricas ir piesaistīts ligands, kurš saistās ar kādu noteiktu proteīnu • Ligands var būt: -metāla joni(Visvairāk izplatītā tehnika!) -antivielas pret noteiktu proteīnu -proteīns, kas saista noteiktu citu proteīnu -mazmolekulārs ligands, kas saista noteiktu proteīnu

48. Antivielu afinitātes hromatogrāfija • Vispirms nepieciešams producēt antivielas pret konkrēto proteīnu • Antivielas ķīmiski piesaista agarozes matricai • Tikai proteīns, pret kuru izstrādātas antivielas piesaistīsies matricai • Parasti eluē ar zemu pH (≈3)

49. Antivielu afinitātes hromatogrāfija • Priekšrocības: -Ļoti selektīva metode • Trūkumi: -nepieciešams producēt antivielas pret jau attīrītu proteīnu -dārgi -var būt grūtības eluēt proteīnu no kolonnas

50. Metālhromatogrāfija Pamatojas uz atsevišķu proteīnu spēju piesaistīt divvērtīgos pārejas metālu jonus Matrica: agaroze ar piesaistītām helatējošām grupām (IMAC agaroze) Helatējošās grupas piesaista divvērtīgos pārejas metālu jonus Proteīni pēc tam piesaistās pie imobilizētajiem metālu joniem