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School of life sciences Nantong University

School of life sciences Nantong University. 水稻类囊体膜脂磷脂酰甘油 (PG) 分子种组成与低温光抑制敏感性的关系. 南通大学生命科学学院. Relationships between Composition of Molecular Species of Phosphatidylglycerol (PG) of Thylakoid Membrane Lipid and Sensitivities to Low Temperature Photoinhibition in Rice ( Oryza sativa L.). 朱 素 琴.

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  1. School of life sciences Nantong University 水稻类囊体膜脂磷脂酰甘油(PG)分子种组成与低温光抑制敏感性的关系 南通大学生命科学学院 Relationships between Composition of Molecular Species of Phosphatidylglycerol (PG) of Thylakoid Membrane Lipid and Sensitivities to Low Temperature Photoinhibition in Rice (Oryza sativa L.) 朱 素 琴

  2. CH2－O－CO－R1 | CH－O－CO－R2 | CH2－O －O－ CH2 | | CH2OH CHOH P 引 言 • 类囊体磷脂酰甘油(PG)因具有较多的饱和脂肪酸和一种特殊的脂肪酸16:1(3t)而被认为是一种对温度最为敏感、在降温过程中最先发生相变(Phase transition temperature)、从而影响膜流动性的分子（Murata N等，1983）, 是一种涉及光合作用活动和植物抗寒性的重要磷脂。

  3. 材料与方法 1.1 实验材料 • 粳稻品种9516 (j-9516)、 • 籼型杂交稻汕优63(i-SY63) 、 • j-9516和i-SY63杂交稻 (ji-95SY)为实验材料， 　在10升盆钵中播种，盆栽于网室自然温光条件下，用常规方法栽培管理。

  4. 本文以大面积生产的高产粳稻9516(j-9516)、籼型杂交稻汕优63(SY63)、j-9516和i-SY63杂交稻(ji-95SY)为研究对象，采用高效液相色谱(HPLC)、酶解方法和薄层色谱技术，研究水稻类囊体膜脂PG分子种组分与低温光抑制敏感性关系，为抗低温光抑制的转基因技术奠定分子基础。本文以大面积生产的高产粳稻9516(j-9516)、籼型杂交稻汕优63(SY63)、j-9516和i-SY63杂交稻(ji-95SY)为研究对象，采用高效液相色谱(HPLC)、酶解方法和薄层色谱技术，研究水稻类囊体膜脂PG分子种组分与低温光抑制敏感性关系，为抗低温光抑制的转基因技术奠定分子基础。

  5. 1.2 实验方法 • 1.2.1 低温中等光处理与低温弱光处理 • 将灌浆期的盆栽水稻移入人工气候室内， • 分别在100和600μmol m-2 s-1两种PFD（光源为石英卤素灯）和11℃温度下处理5d。照光12 h（6:00-18:00），黑暗12h，相对湿度78-82%。 • 在处理的第0 (处理前1d)、1、3、5d的18:00取功能旗叶并分成两组，一组叶片于液氮中固定，用于膜脂分析等，另一组用于测定PSⅡ电子传递活力和经暗适应20min后进行叶绿素荧光参数测定。

  6. 1.2.2 类脂的分离与提取 • 类脂的提取 • 将2 ml类囊体 4.5ml氯仿:甲醇(1:2，V/V)混合液中 振荡混匀，静置10分钟 + 2.7 ml KCl (1 mM)和1.5 ml氯仿 氯仿:甲醇:KCl的最终体积比达到1:1:0.9 离心10分钟(3000 rpm) 收集含有膜脂的下层溶剂 浓缩 -20℃下贮存。

  7. 双向薄层层析法分离膜脂 • 层析板(GF型，10 cm×10cm)购自青岛海洋化工厂。 • 第一向展开液为丙酮:甲苯:水(91:30:8，V/V) • 第二向展开液为氯仿:甲醇:异丙胺:浓氨水(65:35:0.5:5，V/V)。 • 在紫外灯(254nm)下确定不同膜脂在薄板中的位置。

  8. 1.2.3 脂肪酸组分分析 • 按俞国红、苏维埃（1996）方法，甲酯化采用等体积的0.4mol/L KOH的甲醇溶液和苯-石油醚溶液（1:1, V/V）处理。岛津GC-17A气相色谱仪分离脂肪酸，毛细管柱为SP-2330(supelco Inc)，柱长15m，内径0.32mm。测定用柱温165℃，进样和氢火焰检测器温度为250℃。脂肪酸标准样品均购自Sigma公司。

  9. O O || || O O H2 H2 －O－C－R1 －O－C－R1 C | | H2C－OH C | | H2C－O － O NO2 || || || R2－C －O－ R2－C －O－ → CH CH － + C NO2 O NO2 || － (DAG) C (DAG-DNB) (DNBC) NO2 Cl • 1.2.4 PG脂肪酸的定位分析 • 参考Kito等（1985）方法，制备的PG首先用磷脂酶C水解, 酶解产物二酰甘油(DAG)被3,5-二硝基苯甲酰氯（DNBC衍生化）, 得到1,2-二酰基-sn-3-(3, 5-二硝基苯甲酰基)甘油（DAG –DNB），然后进行反相高效液相色谱 (Agilent 1100 series, USA) 分析。

  10. 色谱条件： • SupelcoC18分离柱(15cm×3.0mm i.d), • 流动相乙腈/异丙醇(体积比80∶20), 流速1.0ml/min｡ • 在波长210nm处检测DAG-DNB。

  11. 1.2.5 PSⅡ-D1蛋白量的测定 • 按Kyle等方法配制一系列不同浓度的14C-Atrazine溶液各0. 5 ml，然后加入0. 5 ml叶绿体悬浮液(100μg Chl/ml)，使最终14C-Atrazine系列浓度在0. 04 ~ 0. 48μmol/L之间。振荡1 min，保温10 min , 2200 ×g离心2min，测定上清液的放射性，用双倒数作图法算得D1蛋白含量。

  12. 1.2.6 PSⅡ电子传递活力的测定 • 用OXY−LAB氧电极(英国Hansatech)测定放氧速率（测定温度为28℃）。 • 反应液共同组分: 50mmol/L的Tris-HCl (pH7.8), 10mmol/L的NaCl, 5mmol/L的NH4Cl。另加0.5mmol/L的DCIP用于测定PSⅡ活性（H2O→DCIP）。

  13. 1.2.7 PSⅡ光化学效率(Fv/Fm) 的测定 • 水稻叶片的叶绿素荧光参数用调制式荧光仪（FMS-2，Hansatech）测定[10]。水稻叶片经暗适应处理20min 后测得初始荧光Fo, 再照射饱和脉冲光(6 000μmol m-2 s-1)测得最大荧光Fm，用Fv/Fm值 (Fv/Fm = 1 –Fo/Fm)表示PSⅡ光抑制。Fv/Fm值的降低表明光合机构光抑制加重。

  14. 16:0 18:1 18:2 18:3 16:0 18:2 18:1 18:3 16:0 16:0 16:0 16:0 16:1(3t) 16:1(3t) 16:1(3t) 16:1(3t) P 甘油 P 甘油 P 甘油 P 甘油 P 甘油 P 甘油 P 甘油 P 甘油 结 果 • 2.1 低温(11℃)中等和弱光下水稻类囊体膜PG分子种组分的变化 • PG分子中甘油骨架的sn-1位含16:0或若干C18不饱和脂肪酸（18:1，18:2，18:3）, 在sn-2位是16:1 (3t)和16:0。 • 由于sn-1位、sn-2位上脂肪酸的不同分布和组合，形成了不同的PG分子种，如18:3/16:0 PG、18:3/16:1(3t) PG、18:2/16:0 PG、18:2/16:1(3t) PG、18:1/16:0 PG、18:1/16:1(3t) PG、16:0/16:0 PG、16:0/16:1(3t) PG分子种等。

  15. 11℃ 600μmol m-2s-1 11℃ 100μmol m-2s-1 例如 18:3/16:0~16:1(3t) PGs分子 对照的34.3mol%、31.1 mol%和27.6 mol% 下降到 30.1 mol%、23.8 mol%和17.3 mol%， 16:0/16:0 ~16:1(3t) PGs分子种 对照的12.2mol%、20.3 mol%和28.6mol% 增加到 19.6 mol%、30.8 mol%和42.3 mol%。 • 结果显示，温度能显著改变18:3/16:0~16:1(3t)、18:2/16:0~16:1(3t)、18:1/16:0~16:1(3t)、16:0/16:0 ~16:1(3t) PGs分子水平。 • 在11℃和600μmol m-2s-1光强条件下，随处理时间的延长所有具有不饱和脂肪酸尾链的PG分子种如18:3/16:0~16:1(3t)、18:1/16:0~16:1(3t) PG的含量不断减少，具有饱和脂肪酸尾链的PG分子种16:0/16:0 ~16:1(3t)的含量不断增加。

  16. 11℃ 600μmol m-2s-1 11℃ 100μmol m-2s-1 18:3/16:0~16:1(3t) PGs 对照的34.3mol%、31.1 mol%和27.6 mol% 下降到 30.8 mol%、25.1 mol%和19.1mol%， 而后增加到32.6mol%、28.8 mol%和20.4 mol% 16:0/16:0 ~16:1(3t) PGs 对照的 12.2 mol %、20.3 mol %和28.6 mol% 增加到 17.7 mol%、28.5 mol%和39.5 mol%， 而后下降到 15.6 mol%、25.1 mol%和37.4 mol% • 在11℃和100μmol m-2 s-1光强条件下，所有具有不饱和脂肪酸尾链的PG分子种的含量在处理的3d内不断减少，而后增加；具有饱和脂肪酸尾链的PG分子种的含量在处理的3d内不断增加，而后减少。 • 这些结果清楚地显示，粳稻和籼稻都能通过调整其PG分子种组成以适应低温的变化。

  17. 不饱和脂肪酸水平(ULFA)可以定义为：ULFA=(18:1)mol%+(18:2)mol%×2+(18:3)mol%×3。不饱和脂肪酸水平(ULFA)可以定义为：ULFA=(18:1)mol%+(18:2)mol%×2+(18:3)mol%×3。 • 分析PG分子脂肪酸尾链的不饱和水平(ULFA)，发现ULFA在三个品种间有显著差异。 • 在自然条件下，ULFA在j-9516、ji-95SY和i-SY63中分别为186.3%、168.8%和153.8%。 • 在11℃和600μmol m-2s-1光强条件下，ULFA随处理时间的延长而不断减少，到处理的第5d, 分别减少到165.5%、141.6%和117.3%。 • 在11℃和100μmol m-2s-1光强条件下，ULFA在处理的第3d减少到最低，分别为169.1%、147.1%和122.4%，而后增加，到处理的第5d, 分别增加到175.3%、157.5%和129.5%。

  18. 2.2 低温(11℃)中等和弱光下水稻PSⅡ-D1蛋白量的变化 • 自然条件下，PSⅡ-D1蛋白量在j-9516、i-SY63 、ji-95SY之间无差异，约为1.91μmol mg-1· Chl。 • 在11℃和600μmol m-2s-1光强条件下，D1蛋白量随处理时间的延长而持续减少。到处理的第5天， j-9516、 ji-95SY 、 i-SY63 中D1蛋白量分别为原来的71.3%、66.0%和56.3%。与籼稻汕优63相比，粳稻9516中D1蛋白量下降少， ji-95SY介于两者之间而偏向与母本粳稻(图1)。 • 而在11℃和100μmol m-2s-1光强条件下，处理的前3天中D1蛋白量缓慢下降，分别下降到原来的83.3%、76.4%和69.1%。而后缓慢上升，到处理的第5天分别升至原来的92.2%、83.0%和72.8%。与籼稻汕优63相比，粳稻9516中D1蛋白量下降少，3天后回升得快，籼粳杂交稻 ji-95SY介于两者之间而偏向于母本粳稻(图3)。 图3 低温(11℃)中等和弱光下粳稻9516、籼粳杂交稻 ji-95SY 、籼型杂交稻汕优63(SY63)类囊体膜上D1蛋白量的变化

  19. 2.3 低温(11℃)中等和弱光下水稻PSⅡ电子传递活力和PSⅡ光化学效率(Fv/Fm)的变化 • 自然条件下，PSⅡ电子传递活力 (H2O→DCIP) 和PSⅡ光化学效率 (Fv/Fm) 在三品种之间无显著差异。

  20. 在11℃和600 μmol m-2 s-1光强条件下，PSⅡ电子传递活力 (H2O→DCIP)和PSⅡ光化学效率 (Fv/Fm) 均不断地下降，到处理的第5d，PSⅡ电子传递活力 (H2O→DCIP, O2 μmol mg-1 Chl h-1) 和PSⅡ光化学效率 (Fv/Fm) 在j-9516、ji-95SY和i-SY63中分别减少到39.7和0.56、36.0和0.52、31.6和0.42。 • 在11℃和100 μmol m-2 s-1光强条件下，PSⅡ电子传递活力 (H2O→DCIP) 和PSⅡ光化学效率(Fv/Fm) 开始的前3d处理中先是下降，而后开始回升。其变化趋势与D1蛋白量的变化趋势一致。 • 三品种相比，j9516的变化幅度小、i-SY63的变化幅度大、ji-95SY介于两者之间。

  21. 2.4 低温(11℃)中等和弱光下水稻类囊体膜脂与膜结合蛋白相互作用分析 • 图5表明，低温(11℃)中等和弱光下j-9516、ji-95SY和i-SY63中D1蛋白量和PSⅡ光化学效率(Fv/Fm)分别与类囊体膜上PG分子种尾链脂肪酸的不饱和水平(ULFA)呈极显著的正相关关系（r值分别为0.93和0.85，图5左），与双饱和脂肪酸尾链PG分子的mol%呈极显著的负相关关系（r值分别为-0.95和-0.84）。 图5 低温(11℃)中等和弱光下j-9516、 ji-95SY和i-SY63中几个生理参数的相关分析。

  22. 这从正反两个方面说明水稻类囊体膜上PG分子种尾链脂肪酸的不饱和水平对D1蛋白活性的影响很大。这从正反两个方面说明水稻类囊体膜上PG分子种尾链脂肪酸的不饱和水平对D1蛋白活性的影响很大。

  23. 讨 论 3.1 PG分子尾链脂肪酸不饱和水平与水稻低温光抑制敏感性 • 从低温对膜脂流动性或膜相变影响的角度来看(Lyons, 1973)， 16:0/16:0和16:0/16:1(3t)等饱和分子种因其“高融点”将最先在膜脂中由液晶态转变为凝胶态, 成为植物遭受寒害的原初反应，可以推测PG起着关键的作用。 • 由于PG在类囊体膜、光系统Ⅱ(PSⅡ)、PSⅡ核心复合物、PSⅡ反应中心和光系统Ⅰ(PSⅠ)中都有分布且存在着一定的比例关系（Murata N等，1990），其尾链脂肪酸不饱和度对类囊体膜中D1蛋白的周转速率将起着关键性的影响。

  24. 本研究表明，D1蛋白量分别与PG分子尾链脂肪酸不饱和水平以及饱和PG分子种的mol%呈极显著的正相关和负相关关系。本研究表明，D1蛋白量分别与PG分子尾链脂肪酸不饱和水平以及饱和PG分子种的mol%呈极显著的正相关和负相关关系。 • 粳稻类囊体膜中PG分子尾链脂肪酸不饱和水平较高，饱和PG分子种的mol%较低，类囊体膜脂和D1蛋白较稳定，表现为耐低温光抑制；籼稻中则相反，对低温光抑制敏感。

  25. H2C－O－18:1 | H C－OH | H2C－O－P H2C－O－18:2 | H C－OH | H2C－O－P H2C－O－18:3 | H C－OH | H2C－O－P 16:0-ACP 18:1-ACP H2C－OH | H C－OH | H2C－O－P 18:1/16:0 18:1/16:1(3t) 18:2/16:0 18:2/16:1(3t) 18:3/16:0 18:3/16:1(3t) G3PAT H2C－O－16:0 | H C－OH | H2C－O－P 16:0-ACP 18:1-ACP 16:0/16:0 16:0/16:1(3t) 3.2 抗低温光抑制的遗传改进途径

  26. 甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)对决定籼粳稻PG分子中脂肪酸的不饱和水平是很重要的。所以，将粳稻中的GPAT基因转移到籼稻或籼粳杂种稻中可改变PG分子的不饱和水平和对低温的敏感性。甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)对决定籼粳稻PG分子中脂肪酸的不饱和水平是很重要的。所以，将粳稻中的GPAT基因转移到籼稻或籼粳杂种稻中可改变PG分子的不饱和水平和对低温的敏感性。

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