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高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。

高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压： 150-350*10 5 Pa 高效：大于 30000 塔板 / 米 高灵敏： 10 -9 g （紫外检测）、 10 -11 g （荧光检测）. 第三章 高效液相色谱分析法 HPLC （ High Pertormance Liquid Chromatography ， ） §2-1 高效液相色谱法的特点. 一、 HPLC 与 GC 差别.

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高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。

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  1. 高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 第三章 高效液相色谱分析法 HPLC （High Pertormance Liquid Chromatography，） §2-1高效液相色谱法的特点

  2. 一、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%

  3. 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

  4. 1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置 二、高效液相色谱仪流程图

  5. 三、HPLC的特点和实际应用 1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。

  6. §2-2 基本理论和条件选择 基础 理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程 一、塔板理论

  7. 二、速率理论（与GC对比） 1.

  8. 2）涡流扩散项及其影响 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） 2.

  9. 3）传质阻抗项及其影响

  10. 1． 三、 影响分离的因素

  11. 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右 四、HPLC法中分离条件的选择

  12. 一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（SEC） （ steric exclusion chromatography §2-3各类高效液相色谱法简介

  13. 1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等 一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂

  14. 2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm） （1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6μm 5×104 球形 YQG 3~4μm 8×108 堆积硅珠 YQG 3~4 μm 8×108理想 原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物 （2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物

  15. 3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液

  16. 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性→NLLC 固定液——非极性→RLLC 3．正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分 二、液液分配色谱法（LLC）

  17. 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2．特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱 （一）常规化学键合相 4、化学键合固定相

  18. 1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑ ， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓ 2．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题） 3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF （二）反相键合相固定相

  19. 4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题） （三）正相键合相色谱 1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力 2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3．流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 • 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇

  20. 4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱 6．适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等

  21. 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离 1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸 2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 3）适用：较强的有机酸、碱 三、离子色谱法（IC） 1．反相离子对色谱法（IPC或PIC）

  22. 在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的 1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质——加入酸HAc tR↑，k↑ 碱性物质——加入碱NH3·H2O tR↑，k↑ 调节pH范围：3.0~8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物 2．反相离子抑制色谱

  23. 2．对流动相的要求： 1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的 3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气

  24. 3．洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）

  25. 1．泵： 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用 2．进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期） 2）阀进样：不必停泵，六通阀 §2-4 高效液相色谱仪

  26. 液相色谱

  27. 3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 4．检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光

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