高效液相色谱法:
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高效液相色谱法: 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上,采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 PowerPoint PPT Presentation


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高效液相色谱法: 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上,采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压: 150-350*10 5 Pa 高效:大于 30000 塔板 / 米 高灵敏: 10 -9 g (紫外检测)、 10 -11 g (荧光检测). 第三章 高效液相色谱分析法 HPLC ( High Pertormance Liquid Chromatography , ) §2-1 高效液相色谱法的特点. 一、 HPLC 与 GC 差别.

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高效液相色谱法: 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上,采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。

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高效液相色谱法:

特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上,采用了高压泵、化学

键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实

验技术建立的一种液相色谱分析法。

高压:150-350*105 Pa

高效:大于30000塔板/米

高灵敏:10-9g (紫外检测)、10-11g (荧光检测)

第三章 高效液相色谱分析法 HPLC

(High Pertormance Liquid Chromatography,)

§2-1高效液相色谱法的特点


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一、HPLC与GC差别

1.分析对象的区别

GC:适于能气化、热稳定性好、且沸点较

低的样品;但对高沸点、挥发性差、

热稳定性差、离子型及高聚物的样

品,尤其对大多数生化样品不可检测

占有机物的20%

HPLC:适于溶解后能制成溶液的样品(包括

有机介质溶液),不受样品挥发性和

热稳定性的限制,对分子量大、难

气化、热稳定性差的生化样品及高分

子和离子型样品均可检测

用途广泛,占有机物的80%


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2.流动相差别的区别

GC:流动相为惰性,气体组分与流动相无亲合作用

力,只与固定相有相互作用。

HPLC:流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用

力,能提高柱的选择性、改善分离度,对分离起

正向作用。且流动相种类较多,选择余地广,改

变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用,当

选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相

也可以增大分离选择性。

3.操作条件差别

GC:加温操作

HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小)


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1.贮液罐(滤棒,可滤

去颗粒状物质)

2.高压泵(输液泵)

3.进样装置

4.色谱柱——分离

5.检测器——分析

6.废液出口或组分收集器

7.记录装置

二、高效液相色谱仪流程图


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三、HPLC的特点和实际应用

1、利用其高柱效(n=104片/米),有效分离极复杂

体系中的痕量组分。

正相色谱分离有机溶剂中的物质

反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。

2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对

色谱法分析离子型体的含量。(蛋白质、氨

基酸、常见阴阳离子等)

3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分

离高分子化合物。

4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化

合物。


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§2-2 基本理论和条件选择

基础

理论

热力学理论:塔板理论——平衡理论

动力学理论:速率理论——Vander方程

一、塔板理论


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二、速率理论(与GC对比)

1.


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2)涡流扩散项及其影响

讨论:

1)流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)

2.


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3)传质阻抗项及其影响


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1.

三、 影响分离的因素


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1. 固定相与装柱方法的选择:

选粒径小的、分布均匀的球形固定相

(dp≤10μm)

首选化学键合相,匀浆法装柱

2. 流动相及其流速的选择:

选粘度小、低流速的流动相——甲醇,

约1ml/min

3. 柱温的选择:

选室温250C左右

四、HPLC法中分离条件的选择


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一、液固吸附色谱法(LSC)

(liquid-solid adsorption chromatography)

二、液液分配色谱法(LLC)

(liquid-liquid partition chromatography,

chemical bonded phase chromatography

三、离子色谱法(IC)

(ion-exchange chromatography and

ion pair chromatography)

四、空间排阻色谱法(SEC)

( steric exclusion chromatography

§2-3各类高效液相色谱法简介


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1.分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附

活性中心能力的差异

分离前提:K不等或k不等

一、液固吸附色谱法(LSC) 流动相为液体,固定相为固体吸附剂


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2.固定相:与LC比,固定相粒径不同(<10μm)

(1)硅胶 表孔硅胶(薄壳硅胶)

全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6μm 5×104

球形 YQG 3~4μm 8×108

堆积硅珠 YQG 3~4 μm 8×108理想

原理:吸附

特点:峰易拖尾

适用:分离极性化合物

(2)高分子多孔小球:YSG

原理:吸附+分配

蒹小孔凝胶作用

特点:柱选择性好,峰形好,柱效低

适用:分离弱极性化合物


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3.流动相:底剂(烷烃)+ 有机极性调节剂

例: 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -

4.影响k的因素:与固定相性质和流动相性质有关

溶质分子极性↑,洗脱能力↓,k↑,tR↑

溶剂系统极性↑,洗脱能力↑,k↓, tR↓

注:调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间

5.出柱顺序:强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱

6.硅胶吸水量↑,LSC→LLC

硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大

硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体

吸附的水→固定液


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1.分离机制:利用组分在两相中溶解度的差异

2.固定相:载体+固定液(物理或机械涂渍法)

缺点:系统内部压力大,易流失,不实用

固定液——极性→NLLC

固定液——非极性→RLLC

3.正相色谱——固定液极性 > 流动相极性(NLLC)

极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱

适于分离极性组分

反相色谱——固定液极性 < 流动相极性(RLLC)

极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱

适于分离非极性组分

二、液液分配色谱法(LLC)


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利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面

1.分离机制:分配 + 吸附(以LLC为基础)

2.特点:

不易流失

热稳定性好

化学性能好

载样量大

适于梯度洗脱

(一)常规化学键合相

4、化学键合固定相


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1.分离机制:疏溶剂理论

正相——流动相与溶质排斥力强,

作用时间↑ , k↑,组分tR↑

反相——流动相与溶质排斥力弱,

作用时间↓, k↓,组分tR↓

2.固定相:极性小的烷基键合相

C8柱,C18柱(ODS柱——HPLC约80%问题)

3.流动相:极性大的甲醇-水或乙腈-水

流动相极性 > 固定相极性

底剂 + 有机调节剂(极性调节剂)

例:水 + 甲醇,乙腈,THF

(二)反相键合相固定相


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4.流动相极性与k的关系:

流动相极性↑,洗脱能力↓,k↑,组分tR↑

5.出柱顺序:极性大的组分先出柱

极性小的组分后出柱

6.适用:非极性~中等极性组分(HPLC80%问题)

(三)正相键合相色谱

1.分离机制:溶质分子与固定相之间定向作用力、

诱导力、或氢键作用力

2.固定相:极性大的氰基或氨基键合相

3.流动相:极性小(同LSC)

底剂 + 有机极性调节剂

  • 例:正己烷 + 氯仿-甲醇,氯仿-乙醇


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4.流动相极性与k的关系:

流动相极性↑,洗脱能力↑,组分tR↓,k↓

5.出柱顺序:结构相近组分,极性小的组分先

出柱极性大的组分后出柱

6.适用:

氰基键合相与硅胶的柱选择性相似(极性稍小)

分离物质也相似

氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性

分析极性大物质、糖类等


1 ipc pic

反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分

与其中的反离子形成中性离子对,增加k和tR,以改善分离

1)离子对试剂:烷基磺酸钠→分析碱

四丁基季胺盐→分析酸

2)影响k的因素

a.与m的极性有关(同反相色谱)

b.与R的链长有关:R↑长,极性↓小,tR↑,k↑

3)适用:较强的有机酸、碱

三、离子色谱法(IC)

1.反相离子对色谱法(IPC或PIC)


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在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相pH值,抑制

组分解离,增加其k和tR,以达到改善分离的目的

1)离子抑制剂:弱酸、弱碱性物质

pH一定的缓冲溶液

2)k的影响因素:与流动相极性有关,还与pH值有关

选择流动相:应同时考虑极性及pH值

酸性物质——加入酸HAc tR↑,k↑

碱性物质——加入碱NH3·H2O tR↑,k↑

调节pH范围:3.0~8.0

pH>8.0 破坏键合相与载体的结合

pH<3.0 腐蚀柱子

3)适用:极弱酸碱物质

pH=3~7弱酸;pH=7~8弱碱;两性化合物

2.反相离子抑制色谱


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2.对流动相的要求:

1)与固定液不反应

2)对样品有良好溶解度

k=1~10

k=2~5 最理想的

3)与检测器匹配:

UV(常用,测定波长应大于溶剂的截止波长)

荧光,电化学

4)使用粘度小、纯度高的流动相(甲醇,乙腈)

使用前过滤、脱气


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3.洗脱方式

1)等度洗脱(恒组成溶剂洗脱)

以固定配比的溶剂系统洗脱组分(一个泵)

类似GC的等温度洗脱

2)梯度洗脱:

在一定分析周期内不断变换流动相的种类

和比例

即不断改变其极性(两个泵)

适于分析极性差别较大的复杂组分

类似GC的程序升温(沸程较长样品)


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1.泵:

恒压泵:流量精度不稳

恒流泵:常用

2.进样装置

1)隔膜进样(高分子有机硅胶垫→进样室)

GC系统压力较小,可以

HPLC系统压力太大,必须停泵进样(早期)

2)阀进样:不必停泵,六通阀

§2-4 高效液相色谱仪


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液相色谱


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3.色谱柱:直径4~6mm,柱长10~30cm

柱效评价:色谱系统适应性试验

R,n,fs(拖尾因子)

柱再生:维护、保养、柱子的冲洗

4.检测器

1)紫外检测器:适于吸收紫外光的物质

2)荧光检测器:只能分析自身发光的物质

灵敏度高

3)示差折光检测器:利用折光率的差别

灵敏度低,温度要求严格

4)电化学检测器

5)化学发光


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