Le « Quorum Sensing » des bactéries Gram -

1. Caractérisation structurale d ’un régulateur transcriptionnel du « Quorum Sensing » chez Brucella abortus

2. Le « Quorum Sensing » des bactéries Gram- Production de lumière chez la bactérie marine Vibrio fischeri « Le ‘Quorum Sensing’ est un phénomène par lequel l’accumulation d’une phéromone de faible poids moléculaire permet à la cellule individuelle de percevoir quand l’unité de population minimale ou ‘quorum’ de bactéries est atteint, pour initier une réponse concertée de l’ensemble de la population » (Fuqua 1994) Haute densité cellulaire : Autoinduction de la luminescence

3. luxI luxR luxCDABE Quorum Sensing chez Vibrio fischeri • Lux I : • La synthétase de phéromone + • OHHL : La phéromone ou l ’autoinducteur Lumière • Lux R : • Le régulateur transcriptionnel • activé par OHHL OHHL

4. Caractéristiques structurales des régulateurs de la famille LuxR • actifs sous forme d’un dimère • association à la membrane • organisés en deux domaines structuraux problèmes de purification structures 3D N C Liaison à la phéromone (HSL) Liaison à l ’ADN via un motif Hélice-coude-hélice (HTH)

5. Brucella abortus,notre organisme d ’intérêt • Coccobacille Gram-négatif • Pathogène intracellulaire • Provoque une zoonose qui atteint quelquefois l ’homme Un système de « Quorum Sensing » a récemment été identifié chez cette bactérie et le régulateur transcriptionnel correspondant a été nommé BabR. C’est un homologue de LuxR (25% d ’identité selon l ’alignement donné par ALIGN).

6. OBJECTIF • Caractériser structuralement le régulateur transcriptionnel BabR de Brucella abortus à l’aide d’outils bioinformatiques . • Les différentes étapes suivies: • .Obtenir la topologie de BabR et de ses homologues les plus proches • .Obtenir un modèle 3D du domaine C-terminal de BabR pour pouvoir analyser plus en détail le motif HTH. • .Obtenir le plus d’informations structurales possibles sur le domaine N-terminal de BabR

7. 1 Obtention de la topologie de BabR et de ses homologues

8. BabR Séquence complète Recherche de séquences similaires (BLAST) Sélection des homologues les plus similaires ( E-value < à 0,01) > à 30% d ’identité* avec BabR > à 30% d ’identité* avec BabR + LuxR (prot.réf.) Toutes les séquences Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) * pourcentage d ’identité déterminé par ALIGN

9. > à 30% d ’identité avec BabR + LuxR (prot.réf.) Méthodes de prédictions de structures secondaires pour déterminer la topologie de BabR et des différents homologues ( PHD, PSIpred, PREDATOR, JPRED,PROF) CONSENSUS des méthodes de prédictions de structures secondaires

10. Méthode utilisée pour réaliser le consensus Score PHD Score PSIPRED

11. Consensus des différentes méthodes pour les 11 séquences (BabR et ses homologues ( en moyenne 240 a.a.)) N BabR HOMOL. LuxR Dom. C-term Dom. N-term C HELICE a BRIN b

12. 2 Obtention du modèle 3D du domaine C-terminal de BabR et analyse plus détaillée du HTH

13. Domaine C-Terminal de BabR Recherche d ’homologues dans la banque de structures PDB 1 résultat significatif: NarL (E-value=0,077) Reconnaissance de « Fold » (3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) 1 résultat significatif (4 méthodes sur 5): NarL

14. Détermination d’un consensus des alignements BabR-NarL fournis par différentes méthodes: • Alignements séquence-séquence • Alignements séquence-structure • ALIGNEMENT SEQUENCE-STRUCTURE OPTIMAL : • 61 derniers résidus de BabR alignés de façon certaine avec NarL (dom. Cterm) • Les autres résidus: lien flexible et donc alignement incertain

15. Alignment BabR Cterm.-NarL final

16. Le modèle dudomaine C-terminal de BabR

17. Caractérisation plus détaillée du HTH 1. Analyse de 4 complexes ADN-protéine : -répresseur  -répresseur LexA -répresseur P22 -répresseur Cro Visualisation des ponts H entre le HTH et les bases nucléotidiques de chaque complexe Détermination des résidus de chaque HTH interagissant de manière spécifique avec l ’ADN

18. COMPLEXE HTH-ADN (1QAA)

19. Détermination des résidus interagissant de manière spécifique avec l ’ADN

20. His 212 Ser 205 Thr 208 Asn 215 2. Extrapolation au domaine HTH de BabR (d ’après l ’analyse HTH-ADN et l ’alignement avec LuxR)

21. 3 Caractérisation structurale du domaine N-terminal de BabR

22. Domaine N-Terminal de BabR Recherche de séquences similaires (BLAST): Aucun résultat significatif Reconnaissance de « Fold » (3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) Pas de structure mais 1 topologie donnée par plusieurs méthodes : Le « Rossman Fold »

23. Modèle topologique d ’une protéine de type « Rossman fold »

24. Structure 3D d ’une protéine adoptant une topologie de « Rossman fold »

25. Modèle topologique du domaine N-term. de BabR L ’alignement BabR-LuxR permet de définir sur la topologie les résidus importants dans la liaison à l ’HSL et donc de localiser la région de liaison.

26. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES • But d’un modèle = générer des hypothèses testables au laboratoire • Nous avons généré des hypothèses pour le domaine N-terminal et pour le domaine C-terminal. Nous avons pu caractériser structuralement une protéine de la famille LuxR. • Des résidus ont été prédits comme importants, soit dans la liaison à l’ ADN soit à la phéromone; ils pourront donc être testés par des expériences de mutagenèse dirigée.