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Sequenciamento de DNA

Sequenciamento de DNA. 1977 Max & Gilbert (Harvard – USA) Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra) Método para determinar a sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNA pela síntese dessa molécula in vitro. Método de Sanger (enzimático ou de terminação de cadeia).

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Sequenciamento de DNA

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Presentation Transcript

  1. Sequenciamento de DNA • 1977 • Max & Gilbert (Harvard – USA) • Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra) Método para determinar a sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNApela síntese dessa molécula in vitro

  2. Método de Sanger(enzimático ou de terminação de cadeia) • DNA em fita simples (molde) • Primer (iniciador da síntese) • Desoxinucleotídeos (dNTP – A, T, G, C – marcados radioativamente) • Dideoxinucleotídeo (ddNTP) • Enzima polimerase

  3. didesoxi rribonucleosídeo trifosfato Desoxi rribonucleosídeo trifosfato Previne a extensão da fita no final 3’ Permite extensão da fita no final 3’ Componentes do sequenciamento HHHH H

  4. Método enzimático para sequenciamento de DNA (Sanger e col., 1977) 5’ 3’ DNA fita dupla GCATATGTCAGTCCAG 3’ 5’ CGTATACAGTCAGGTC DNA fita simples 3’ 5’ CGTATACAGTCAGGTC 5’ 3’ Iniciador GCAT + DNA polimerase + excesso de dATP, dTTP, dGTP, dCTP +ddTTP +ddATP +ddCTP +ddGTP A AT ATGTC ATG GCAT GCAT GCAT GCAT ATGTCA ATGT ATGTCAGTC ATGTCAG GCAT GCAT GCAT GCAT ATGTCAGTCCA ATGTCAGT ATGTCAGTCC ATGTCAGTCCAG GCAT GCAT GCAT GCAT

  5. Método de sequenciamentoenzimático (manual)

  6. Método enzimático para sequenciamento de DNA (Sanger e col., 1977) 3’ G A C C T G A C T G T A A T C G 5’

  7. G A C T G T G C A C G G C C T C C C T G His  Gln • Sequenciamento direto de DNA (gene a2) de portador daHb Westmead (a122 HisGln)

  8. Sequenciamento automático • Permite a análise simultânea de diversos segmentos de DNA • Utilizado para sequenciamento de larga escala • Nucleotídeos marcados com fluorocromo (quatro corantes diferentes) • Emitem luz em diferentes comprimentos de ondas quando excitados por um laser

  9. DNA de fita simplescom o inserto clonadoa ser sequenciado Sequenciamentoautomático de DNA Adição deconstituintes dasreações de sequenciamento Terminadores didesoxi Primer universal doM13 com marcadorfluorescente Fitas de DNA sintetizadomarcadas Mistura dasquatro reações Excitação do marcador fluorescente com laser Processamento dos por um computador Detecção com fotomultiplicador

  10. Sequenciamento de DNA automático 5’ 3’ DNA fita dupla GCATATGAG 3’ 5’ CGTATACTC Terminadores dideoxi ddCTP ddTTP ddGTP ddATP + + + + Primer com marcadores fluorescentes GCAT GCAT GCAT GCAT CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTC

  11. Sequenciamento de DNA automático Mistura das 4 reações de sequenciamento Resultados processados em um computador Fotomultiplicador Laser Gel de sequenciamento

  12. Timina Adenina Guanina Citosina

  13. Sequenciamento de DNA C C T C G A A A C A A A A A A G G A A T T A G G T

  14. 1 2 3 4 1 2 1 GA nt 30.864, aa248, Arg Gln CGA  CAA

  15. 1 2 G (normal) 1 2 3 4 1

  16. 1 2 1 2 3 4 1 G/A (heterozigota) R

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