第三章生化检验实验室基本知识

第三章生化检验实验室基本知识 第一节实验用纯水第三节实验方法的选择第二节实验用玻璃仪器第四节实验方法的评价第五节实验的诊断性能评价

第一节实验用纯水 水是常用的溶剂，天然水中含有许多杂质，如悬浮物、胶体物质和溶解物质，必须经处理去除杂质成为纯水，才能用于生物化学实验。否则，将严重影响实验结果的准确度和精密度。一、纯水的制备方法（一）蒸馏法将自来水在蒸馏器中加热气化，然后冷凝水蒸气即得蒸馏水，必要时可将蒸馏水再进行蒸馏得双蒸水。蒸馏水在25℃时的电阻率为1×105Ω/cm左右。

（二）离子交换法 将自来水通过离子交换柱去除水中杂质的方法。离子交换树脂是一种人工合成的带有交换活性基团的多孔网状结构的高分子化合物，在网状结构的骨架中，含有许多能溶液中的离子起交换作用的“活性基团”。当水通过阳离子交换树脂时，水中带正电荷的阳离子与树脂中的H+交换，而水中带负电荷的阴离子则与树脂中的OH－交换。离子交换水在25℃时的电阻率为5×106Ω/cm左右。

二、水的纯度检查 水的纯度检查包括用电导仪测定其电导率或电阻率，用特定试剂检测水中残留的Ca2+、Mg2+、Cl－、SO42－等成分，细菌培养计数菌落。 1. 电阻率用电导仪或兆欧表测定，用电导仪测得的电导率，可与电阻率进行换算。电导单位为西门子（s），电导是电阻的倒数，即1s=1Ω－1；每cm长的电导为电导率（s·cm－1）。

2.可溶性硅检验 定性方法：纯水10ml加1%的钼酸溶液15滴，草酸与硫酸的混合液（4%草酸1份，加4mol/L硫酸3份）8滴，混匀，置室温10分钟，滴加1%硫酸亚铁溶液5滴，摇匀，以不显蓝色为合格（≤0..5mg/L） 3. 细菌菌落计数按常规菌落计数法进行。 4. 实验用纯水标准及用途1976年，CAP提出了实验用水的三级标准，1985年，NCCLS又提出了新标准。

生化试剂及生化检验用水标准（CAP） 特性指标 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 pH 6.0～7.0 6.0～7.0 6.0～7.0 电导率（μs/cm，25℃）＜0.1 ＜ 2.0 ＜5.0 电阻率（MΩ/cm， 25℃ ）＞10 ＞0.5 ＞0.2 硅酸盐（mg/L）＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重金属（mg/L）＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

NCCLS、CAP规定的等级纯水的用途 级别用途 NCCLS Ⅰ 原子吸收、火焰光度、电解质、荧光、酶、高灵敏度层析、电泳、参比液、缓冲液 Ⅱ 一般实验检验、玻璃器皿冲洗 Ⅲ 玻璃器皿洗涤、要求不高的定性实验 CAP Ⅰ 原子吸收、火焰光度、电解质、血气及pH 、酶、缓冲液、无机元素、参比液 Ⅱ 一般实验检验、血液学、血清、微生物检验等 Ⅲ 普通定性测定、尿液检验、组织切片、寄生虫、器皿洗涤

第二节实验用玻璃仪器 实验用玻璃仪器分为容器类和量器类。容器类玻璃仪器为常温或加热条件下，物质的反应容器和贮存容器，如试管、烧杯、锥形瓶、试剂瓶等。量器类玻璃仪器用于计量溶液体积，不能作为实验容器，如量筒、容量瓶、移液管、吸量管、滴定管等。

一、普通玻璃仪器的使用 （一）量筒用于不太精确的液体计量。不能用做反应容器，不能装热的液体。（二）容量瓶用于把精确称量的物质配置成准确浓度的溶液或是将准确容积及浓度的浓溶液稀释成准确浓度及容积的稀溶液。容量瓶与瓶塞要配套使用，使用时不要一次性将溶液加至刻度。容量瓶不能烘烤。

（三）移液管、吸量管 移液管和吸量管是用于准确量取一定体积液体的量出式的玻璃量器。移液管用于吸取固定量的溶液。最精确。吸量管是具有分刻度的玻璃管，用于吸取非固定量的溶液。（四）自动加样器俗称加样枪，有固定式和可调式两种。其精密度和准确度高于吸量管。

二、普通玻璃仪器的清洗 初用玻璃仪器的清洗新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用肥皂水（或去污粉）洗刷再用自来水洗净，然后浸泡在l％～2％盐酸溶液中过夜（不少于4小时），再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3次，在100℃～130℃烘箱内烤干备用。

二、普通玻璃仪器的清洗 使用过的玻璃仪器的清洗 1.容器类玻璃仪器如试管、烧杯、锥形瓶等。先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取去污粉（掺入肥皂粉）或浸入肥皂水内。将器皿内外（特别是内壁）细心刷洗，用自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗2～3次，烤干或倒置在清洁处，干后备用。

使用过的玻璃仪器的清洗 2.量器类玻璃仪器如吸量管、滴定管、容量瓶等。使用后应立即浸泡于凉水中，勿使物质干涸；然后用流水冲洗，除去附着的试剂、蛋白质等物质。晾干后浸泡在铬酸洗液中4～6小时（或过夜），再用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～4次，晾干备用。

使用过的玻璃仪器的清洗 3. 其它具有传染性标本的容器，如病毒、传染病患者的血清等动污过的容器。应浸泡在杀菌剂（5％煤酚皂溶液）中过夜，进行消毒后再清洗。

清洁液的配制和使用 配制时，先将重铬酸钾溶于水中，加热助溶，待冷。然后将粗浓硫酸缓慢加人上液中，边加边搅拌，切勿过快，以免产生高热使容器破裂。不要把重铬酸钾溶液向硫酸中倾倒！！！配制时，根据用量选用烧杯或陶瓷缸作容器。

清洁液的配制和使用 清洁液的腐蚀性强，用时注意勿溅在皮肤和衣服上。它的吸水性较强，故应加盖贮存。如果清洁液的颜色逐渐变为绿色，表示效力降低，再加人适量的重铬酸钾和浓硫酸，还可继续使用；如已变成黑色，则不能再用。清洁液适用于事先清洗过但未能洗净的玻璃器皿，将水甩干后浸泡。未清洗或未消毒的器皿不要直接浸泡于清洁液中，否则会使清洁液迅速失效，减低洗涤能力。

第三节实验方法的选择 一、方法选择的目的和意义目的：选择精密度和准确度符合临床要求，快速，操作简便，成本低的检测手段。意义：分析方法的选择是生化检验质控的基础，而方法学评价是方法选择的依据，由此可见，方法的选择与评价是全面质控工作中必不可少的重要环节。

试验方法的选择和评价过程示意图 方法选择 ↓ 实验 ↓ 方法评价发展 ↓ 调整　　　　常规应用 ↓ ↑ 预防措施　　　统计质控结果报告

二、实验方法的分级 国际临床化学联合会（IFCC）根据分析方法准确度和精密度的不同分为三级（一）决定性方法：是指经过彻底研究未发现任何不精密和不准确因素的测定方法。测定结果最接近“真值”。主要是美国国家标准局和英国的研究中心，用于评价参考方法与标准品。

（二）参考方法：是指精密度和准确度稍低于决定性方法，其各种轻微干扰因素为已知的分析方法。用于鉴定常规方法。（二）参考方法：是指精密度和准确度稍低于决定性方法，其各种轻微干扰因素为已知的分析方法。用于鉴定常规方法。（三）常规方法：这类方法的性能指标符合临床或其它目的需要，有足够的灵敏度，准确度和特异性。

三、标准试剂的分级 标准试剂（标准品、参考物）是一种物理或化学性质已充分确定用来校正仪器或证实某种实验方法的物质。 1. 一级标准品（原级参考物）是一种已经确定的稳定而均一的物质。其数值已由决定性方法确定，所有杂质均已定量，并附由证书。

2. 二级标准品（次级参考物） 这类物质包括纯物质（水或有机溶剂溶液）和生物源性介质（透析后血清）中含有参考物质成分的制品。用于常规方法的标化或质控物定质。 3. 质控物质用生物活性介质制成，用原级或次级参考物质为标准，采用参考方法定值，用于常规室内、室间质控。

四、实验方法选择的原则 选择方法需考虑下列三个方面的性能 1. 方法学特性是指提供最好性能的那些根本因素，常与反应的灵敏度及特异性有关。包括化学反应原理、最适反应条件、标化方法及分析操作的严密性等。

2. 工作特性 是证明方法性能的那些因素，包括分析测定范围（线性或工作范围）、精密度、回收率、干扰、准确度及检出限度等。 3. 应用特性即实用性、成本费用、标本来源与种类、样品用量、分析速度，对设备条件与操作技术要求，方法的安全性。

五、实验方法选择的步骤 （一）广泛查阅文献根据方法选择的要求对各种方法进行比较，了解各方法的科学依据和使用价值。（二）选定候选方法根据本实验室的设备条件、人员素质、工作量等具体情况，选择合适的方法。（三）候选方法的初步实验包括：①标准曲线和重复性；②质控血清和标本的重复试验；③分析不同浓度标本，与参考方法的结果对比。

第四节实验方法的评价 第四节实验方法的评价实验方法评价的过程就是对实验误差的测定。根据评价实验的结果和方法性能判断的标准，决定该方法是否可以被接受。一、实验误差是指给出值（包括测定值和标称值）与客观真值的不符合性。

（一）实验误差的来源 1.仪器误差 2.环境误差 3.人员误差 4.方法误差

（二）实验误差的分类 1. 系统误差：指一系列测定结果与真值有同一倾向的偏离。由恒定的原因引起，具有单向性，在一定条件下重复出现，可校正。系统误差又分为恒定误差（CE）和比例误差（PE）。恒定误差：是指由干扰物引起的使测定值与真值存在恒定大小的误差。误差大小与被测物浓度无关，而与干扰物浓度相关。比例误差：是指相对于被测物浓度有相同的百分比误差，误差的绝对量与被测物浓度呈正比。

2. 偶然误差（随机误差）：是一类不易测定的偏差，以偶然不可预料的方式出现，没有一定的大小和方向，可正可负，数据呈正态分布。不可避免，也不可校正。 3. 过失误差：由于工作人员责任不强，工作粗枝大叶，操作不正确所引起的误差。

（三）实验误差的表示方法 1.平均误差是指一组测定值中，测定值与均值之差的平均值。即算术平均偏差，用dm表示。 2.标准差是方差的平方根值，用S表示。是表示精密度的较好指标。

3.绝对误差和绝对偏差绝对误差是指实验测定值与客观真值之差。3.绝对误差和绝对偏差绝对误差是指实验测定值与客观真值之差。绝对误差＝测定值－真值测定值与测定均值间的差异称为绝对偏差。绝对偏差表示误差绝对值的大小，不能表示测定误差之间的大小。绝对偏差＝测定值（X）－测定均值（X）－

4.相对误差和相对偏差相对误差为绝对误差与真值的百分比。相对偏差为绝对偏差与测定均值的百分比。4.相对误差和相对偏差相对误差为绝对误差与真值的百分比。相对偏差为绝对偏差与测定均值的百分比。

5.变异系数（CV）是样本标准差与样本均数的百分比值。用于比较各组数据间的变异情况，不受单位影响，CV值越大，说明测定值离散度越大，精密度越差。5.变异系数（CV）是样本标准差与样本均数的百分比值。用于比较各组数据间的变异情况，不受单位影响，CV值越大，说明测定值离散度越大，精密度越差。

二、方法评价的基本内容和步骤 （一）方法评价的基本内容通过实验途径，测定并评价方法的精密度和准确度。但在实验中实际测定的是不精密度和不准确度，强调的是误差，评价实验就是对误差的测定。

方法评价实验与实验误差类型的关系

（二）方法评价步骤 1.评价前实验研究候选方法的最适条件。包括试剂浓度、缓冲液的种类、离子强度和pH值、反应的温度和时间、检测波长等。 2.初步评价包括批内和日内重复性试验、回收试验、干扰试验等。 3.最后评价包括日间重复性试验、方法比较试验和总体判断方法是否可接受。 4.评价后实验进行临床相关研究，包括参考值确定和特殊病人标本的测定等。 5.方法应用建立质控系统，培训操作者，引入常规工作等。

三、方法评价指标 1. 精密度是指对同一样品多次测定，每次测定结果与均值的符合程度。是表示测定结果中随机误差大小的指标。精密度有批内、天内和天与天之间的精密度之分，表示精密度的指标有标准差（s）、变异系数（CV）、标准误、平均偏差等。评价精密度的方法有平行试验和重复性试验。

2. 准确度指测定值与真值之间的符合程度。一般用偏差和偏差系数表示。准确度没有度量指标，往往以不准确度来衡量，即重复测定的均值与真值之差。准确度主要受系统误差支配，也受随机误差的影响。评价准确度的方法由于回收试验、干扰实验、对比试验。

3. 灵敏度是指化学反应中能检出的最低量。分mg、ug、pg等数量级水平，在方法学评价时，用最低检出量或摩尔吸光系数作为灵敏度指标。 4. 特异性指分析测定中对某一成分起反应，其他物质对反应无影响或基本无影响。评价特异性的方法有干扰试验。 5. 线性范围是指实验方法所能检测标本中某物质的浓度范围。通过线性试验确定。

四、评价试验 （一）重复性试验目的是考察候选方法的随机误差，评价方法的精密度。分为： 1.批内重复性试验在很短的时间内对同一样品进行重复（一般为20次），计算、S、CV，CV一般应小于5%。 2.天内重复性试验同一天内对同一样品作数批重复测定，天内CV值大于批内CV值。 3.天与天之间重复性试验在一段时间内将同一样每天一次随机插入常规标本中测定，反映实际工作情况，其CV大于批内CV、天内CV值。

回收浓度 加入浓度标准液量（ml）病人样品量＋标准液量（ml）加入浓度＝×标准液浓度回收率（%）＝×100 （二）回收试验目的是检测比例误差，以衡量分析方法的准确度。 1.方法是在样品中加入一定量被测物质，然后用同样方法测定，测得值与理论值之比乘以100%即为回收率，合格的回收率应为100%±5 %。 2.计算回收浓度＝分析标本测得浓度－基础标本测得浓度

3.注意事项： （1）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规要求操作。（2）加入标准液后的浓度应达到医学决定水平，同时应在该方法的线性范围内。（3）加入标准液的体积应在总体积的10%以内。（4）一般应做高、中、低不同浓度标准液的回收试验，计算平均回收率。（5）为了减少随机误差对检测比例误差的干扰，最好能重复测定2～3次。

举例某法测定血糖回收率的标本制备和测定结果如下：（1）样本制备： ①基础样本：血清2ml＋蒸馏水0.1ml ②分析样本1：血清2ml＋25mmol/L葡萄糖标准液0.1ml。 ③分析样本2：血清2ml＋100mmol/L葡萄糖标准液0.1ml。（2）按操作要求测定上述样本，将结果填入下表血糖回收试验结果

105＋99.4 2 平均回收率＝×100%＝102.2% 回收率的理想值为100%，现在的平均回收率为102.2%，比例误差为2.2%，表明当一个标本的葡萄糖浓度为5.5mmol/L时，用该法测定值为5.62mmol/L，误差为0.12mmol/L（5.5mmol/L×2.2%）。

（三）干扰试验目的是检测恒定误差，以衡量方法的特异性和准确度。 1.方法基本与回收试验一样，但在标本中加入的是疑有干扰作用的物质。用候选方法对未加干扰物和加入干扰物的两种标本同时测定，两者之差即表示该干扰物产生的干扰所引起的误差，即干扰值。干扰值＝分析标本测得值－基础标本测得值

举例尿酸对GOD-POD法测定血糖的干扰： （1）样本制备： ①基础样本：血清0.9ml＋蒸馏水0.1ml ②分析样本1：血清0.9ml＋4mmol/L尿酸标准液0.1ml。 ③分析样本2：血清0.9ml＋8mmol/L尿酸标准液0.1ml。（2）用GOD-POD法测定上述样本，将结果填入下表干扰实验检测结果（mmol/L）

干扰值1＋干扰值2 加入尿酸值1＋加入尿酸值2 0.30＋0.55 0.40＋0.80 ＝＝0.7mmol/L 单位浓度尿酸使葡萄糖减少值＝测定表明血清尿酸0.4mmol/L时，可使血糖测定结果约减少0.28mmol/L。

3.注意事项 （1）被试验的物质根据方法的原理，提出可能的干扰物。一般应考虑的因素是胆红素、溶血、脂血、抗凝剂等。（2）可疑干扰物的浓度加入可疑干扰物的浓度须达到有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后应测定在何浓度时，产生的误差在临床上无意义。（3）本试验检测的误差包括方法特异性不高和干扰物的作用所引起的误差。

4.消除干扰的常用方法 （1）作空白试验。包括试剂空白和标本空白。（2）采用物理、化学方法分离去除干扰物质。（3）采用双波长或多波长检测方法排除干扰。

（四）对比实验 对比实验可检测方法的系统误差，经统计分析后可提供系统误差的性质，属比例误差还是恒定误差。对一组病人的样品同时用候选方法与参考方法测定，并统计量组结果有无显著性差异。（统计方法、配对t检验、直线回归）一般P＜0.01者，该候选方法不能采用，

第三章 生化检验实验室基本知识