Tema 3.
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Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicos Métodos de análisis PowerPoint PPT Presentation


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Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicos Métodos de análisis. contenido. • Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades f ísicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación

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Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicos Métodos de análisis

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Presentation Transcript


Tema 3.

Propiedades de los ácidos nucleicos

Métodos de análisis


contenido

• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2)

• Propiedades físicas: - absorción luz UV

- desnaturalización

- reasociación

- viscosidad

• Caracterización: - efecto hipercrómico

- curvas Cot

- secuenciación (tema 29)

• Aislamiento y caracterización: - centrifugación

- electroforesis

• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern

- amplificación (PCR - tema 29)


UV

Absorción de luz ultravioleta (UV)


desnaturalización y reasociación


viscosidad

  • Viscosidad del DNA en solución

  • disminuye al

  • fragmentarse:

  • agitación mecánica, sonicación (ultrasonido)

  • desnaturalizarse:

  • calor, baja fuerza iónica, pH alcalino, urea, …


efecto hipercrómico


efecto hipercrómico por desnaturalización del DNA


cinética de reasociación


Curvas Cot


Cot1/2 = 1/k

Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla

X R = f N

1/2 = 1/(1 + k Cot )

1/2

X = a Cot

1/2


genoma nuclear humano


no todo el DNA codifica proteínas

Britten y Kohne, 60’s


centrifugación

rotores y centrífugas


centrifugación diferencial


centrifugación zonal

gradiente

de sacarosa

separación

por tamaño


centrifugación isopícnica

gradiente

de CsCl

separación

por densidad


SeparaciónDNA2c y DNAss

1. centrifugación isopícnica

2. tratamiento con nucleasas específicas de

DNA2c o DNAss

3. columnas de hidroxiapatito:

retienen DNA2c y pasa el DNAss (el DNA2c puede ser eluido aumentando la temperatura o la concentración salina)

4: filtros de nitrocelulosa: unen DNAss y no DNA2c


electroforesis


marcaje radiactivo

radio


isótopos pesados

- isótopos más usados en biología:

N14 y N15; C12 y C13

- uso en centrifugación isopícnica


hibridaciónmolecular


hibridación DNA/RNA


hibridación en filtro


hibridación en colonia


FISH


FISH

centrómeros

telómeros


cariotipo espectral humano


chips de DNA


microarrays


la solución sube a través del gel

al filtro y a la pila de papeles absorventes

pocillos con DNA

esponja

gel

filtro

electroforesis

gel

Southern

DNA en

el filtro

solución salina

transferencia

hibridación

con una sonda

electroforesis +

transferencia +

hibridación =

Southern

la sonda hibrida

con las secuencias

complementarias

el filtro se expone a

una película o una

placa sensibles

Southern


electroforesis

hibridación


Southern (DNA)

Northern (RNA)

Western (proteínas)


problemas

capítulo 1

2ª ed.: 14-24 (el 23 no)

3ª ed.: 14-23

1 h de clase: 30-octubre-2009


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