Curso análisis de semen según los criterios de la OMS-2010 (2ª parte)

1. Mariam Cortés Tormo R2 Análisis clínicos Curso análisis de semen según los criterios de la OMS-2010 (2ª parte)

2. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Viscosidad • Apariencia • Volumen • pH ¿ Qué hacemos con la muestra recogida? Identificar la muestra Introducirla en estufa 37ºC Si es posible someter a rotación con un agitador orbital Iniciar la observación preferiblemente a los 30 min Nunca después de 1 h.

3. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Viscosidad • Apariencia • Volumen • pH • La licuefacción se ensaya visualizando la muestra • Una muestra normal es una muestra licuada y homogénea • Tras la eyaculación el semen es una muestra semisólida coagulada • A los pocos minutos comienza a licuarse y a homogeneizarse ¿Qué pasa sí encontramos hilos de moco y cuerpos gelatinosos? • Sin importancia clínica • Dificultan el análisis • Intentar eliminarlos a la hora de manipular la muestra para las diferentes pruebas

4. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Ocurre, normalmente, dentro de los primeros 15min. a Tª ambiente • Si en 60min. no ha licuado hay que reseñarlo • Si hay dudas sobre la licuefacción, se puede observar al microscopio Típica imagen de una muestra no licuada Manchas que recuerdan acúmulos de grasa

5. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción ¿ Qué ocurre si no licua a los 60 min.? Hay que licuarla Evitar la formación de burbujas para no alterar la muestra

6. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Viscosidad • Apariencia • Volumen • pH • Ensayo de la viscosidad: • Con pipeta pasteur, dejando caer la muestra gota a gota • Introduciendo varilla de vidrio en la muestra

7. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Viscosidad • Una muestra con viscosidad es homogénea. No confundir con licuefacción • Alta viscosidad interfiere con las determinaciones de movilidad, concentración, anticuerpos antiespermatozoide y bioquímica • Se elimina igual que en el caso de no licuefacción

8. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Viscosidad • Apariencia • Volumen • pH Un semen normal debería ser homogéneo, gris opalescente

9. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Viscosidad • Apariencia • Volumen • pH Mediante pesada: Densidad = 1 Masa= Volumen Pesar el recipiente (con etiqueta)= A Pesar el recipiente con el semen = B (B – A) = nº gramos = nº ml Recipientes de recogida graduados: Medida directa del volumen No medir el volumen mediante transferencia a pipetas, jeringas o probetas, etc La transferencia da lugar a mayores errores que con métodos anteriores

10. Análisis de semenEvaluación inicial macroscópica • Licuefacción • Viscosidad • Apariencia • Volumen • pH Refleja el balance entre las diferentes secreciones, principalmente entre el pH alcalino de las vesículas seminales y el ácido de la próstata • Usar tiras 6.0-10 • Chequear el color antes de 30 sg • Chequear las tiras reactivas con soluciones patrón de pH Límite inferior de referencia = 7.2 pH < 7.0 + oligo/azoospermia + volumen bajo Sugiere agenesia u obstrucción de vesículas seminales y/o conductos deferentes

11. Análisis de semenEvaluación inicial microscópica • Microscopio de contraste de fases (se aconseja atemperado a 37 ºC • Observación a 100x (10x10) • Agregaciones • Aglutinaciones • Células no espermáticas • Observación a 200x-400x (10x20; 10x40) • Estimación de la dilución para calcular la concentración espermática • Movilidad espermática

12. Análisis de semenEvaluación inicial microscópica

13. Análisis de semenEvaluación inicial microscópica • Muestra a 37º C • Homogeneizar bien la muestra: • Ideal utilizar agitador orbital • Aspirar la muestra 10 veces con pipeta de plástico de 1,5 mm diámetro Una falta de homogeneización provocará:

14. Análisis de semenEvaluación inicial microscópica Agregaciones • Adherencia de espermatozoides (inmóviles o móviles) a células no espermáticas o detritos • Son no específicas. Ninguna significación clínica

15. Análisis de semenEvaluación inicial microscópica • Aglutinaciones • Espermatozoides móviles unidos a otros spz. Móviles • Son específicas. Pueden tener significación clínica • No son evidencia suficiente para deducir presencia de Ac antiespermatozoides, pero sí nos sugieren investigar su presencia

16. Análisis de semenEvaluación inicial microscópica • Células no espermáticas

17. Análisis de semenMovilidad • Clasificación PR: espermatozoides con movimiento progresivo, bien lineal o círculos amplios , independientemente de la velocidad

18. Análisis de semenMovilidad • Protocolo Contar al menos 5 campos/porta Contar al menos 200 spz/porta Hacer doble contaje

19. Análisis de semenMovilidad • Evaluación de resultados Se utiliza la gráfica del intervalo de confianza del 95% para diferencias entre dos porcentajes Es el máximo error esperado entre dos contajes en el 95% de los casos cuando el único error es atribuible al contaje Sí es >, preparar y contar 2 nuevas preparaciones de la muestra

20. Análisis de semenMovilidad • Evaluación de resultados • Ejemplo: • Muestra (x2) en porta 400x • IM : 1º =38 ; 2º =50 Supera la diferencia máxima admisible que está alrededor de 9

21. Análisis de semenMovilidad • Evaluación de resultados

22. Análisis de semenConcentración • Observación previa • Dilución según observación • Contaje en cámara por duplicado • Evaluar resultados • Cálculo final de la concentración

23. Análisis de semenConcentración • Observación previa

24. Análisis de semenConcentración • Observación previa • Dilución según observación • Contaje en cámara por duplicado • Evaluar resultados • Cálculo final de la concentración • Material necesario: • Pipetas de desplazamiento directo • Pipetas automáticas normales, de desplazamiento por aire • Medio de dilución Weigman

25. Análisis de semenConcentración • Dilución según observación

26. Análisis de semenConcentración • Observación previa • Dilución según observación • Contaje en cámara por duplicado • Evaluar resultados • Cálculo final de la concentración • Cámaras de recuento recomendadas: • Hemocitómetro (100 μm de profundidad) • Muestras fijadas • Cámaras de recuento NO recomendadas: • Cámaras de pequeño volumen= pocos spz • Cámaras llenadas por capilaridad= llenado desigual • Muestras no fijadas= spz móviles

27. Análisis de semenConcentración • Contaje en cámara por duplicado

28. Análisis de semenConcentración • Contaje en cámara por duplicado • Empezar a contar en la rejilla 5 hasta 200 spz • Contar filas completas • Si en una fila no llegamos a 200 spz seguir por la otra fila • Si en mitad de una fila llegamos a 200 spz hay que seguir contando hasta acabar la fila • Si con la 5 no completamos los 200 spz seguimos por la 4 y luego por la 6 • Cuando se hace la dilución ½ hay que contar todas las rejillas

29. Análisis de semenConcentración • Contaje en cámara por duplicado

30. Análisis de semenConcentración • Observación previa • Dilución según observación • Contaje en cámara por duplicado • Evaluar resultados • Cálculo final de la concentración Si la diferencia entre los dos contajes supera el límite permitido habrá que empezar desde el principio, preparar dos nuevas diluciones y realizar de nuevo el doble contaje

31. Análisis de semenConcentración • Observación previa • Dilución según observación • Contaje en cámara por duplicado • Evaluar resultados • Cálculo final de la concentración

32. Análisis de semenConcentración • Valores límite y su IC 95%

33. Análisis de semenConcentración Cámara Makler • Fácil de usar • Se carga con 10μl de semen • Se cuenta toda la cuadrícula el resultado divido entre 10 es la concentración en millón/ml • Se evalúa a la vez concentración y movilidad • ¿Por qué la OMS no aconseja su uso? • Volumen bajo (profundidad 10 μm) • Mayor dificultad movimiento spz • Menos exacto en concentración • Dificultad para fijar el cubre • Mayor riesgo de error Estandarización Control de calidad

34. Análisis de semenMorfología • Protocolo • Muestras por duplicado • Limpiar vigorosamente los portas con papel e identificar

35. Análisis de semenMorfología • Protocolo

36. Análisis de semenMorfología • Protocolo • Tinciones

37. Análisis de semenMorfología • Protocolo • Tinción Diff-Quik Observación en 100x (inmersión) Contar al menos 200spz Muestras por duplicado

38. Análisis de semenMorfología • Clasificación

39. Análisis de semenMorfología • Clasificación No se cuentan ni los flagelos ni las cabezas sueltas v

40. Análisis de semenMorfología • Evaluación de resultados Si el error es mayor, no es necesario volver a repetir las preparaciones pero sí el contaje El límite inferior de referencia en este nuevo manual es del 4%, a diferencia del 15 % del manual anterior

41. Análisis de semenVitalidad • Fundamento • Es una medida indirecta del estado de la membrana plasmática • Espermatozoide intacto = membrana intacta • Espermatozoide muerto = membrana dañada • Debe realizarse rutinariamente en todas las muestras • Es importante cuando la movilidad progresiva es < 40%

42. Análisis de semenVitalidad • Fundamento No existe un alto grado de correlación entre Test colorantes y Test hipoosmóticos ya que miden efectos característicos distintos de la membrana plasmática

43. Análisis de semenVitalidad • Fundamento colorantes

44. Análisis de semenVitalidad • Eosina

45. Análisis de semenVitalidad • Eosina/Nigrosina • Mejor contraste de la imagen Permite guardar y reevaluar la muestra

46. Análisis de semenVitalidad • Imágenes de la coloración • Si sólo se tiñe la zona del cuello o la cabeza tiene una ligera coloración rosa se considerará el spz como vivo

47. Análisis de semenVitalidad • Fundamento hipoosmótico

48. Análisis de semenVitalidad Miden estado funcional de la membrana plasmática • Asociación de las dos técnicas Miden el estado estructural de la membrana plasmática

49. Análisis de semenVitalidad • Evaluación de resultados El límite inferior de referencia en este nuevo manual es de 58% a diferencia del 75% del manual anterior

50. Análisis de semenVitalidad • Utilidadevaluación resultados movilidad • descartar problemas recogida muestra • sdme kartagener