Stanovení katecholaminů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií

1. Stanovení katecholaminů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií RNDr. Alice Vránková Laboratoř endokrinologie a metabolismu ÚKBLD a III.interní kliniky 1. LF UK, Praha, Česká Republika

2. Katecholaminy a jejich metabolismus - Alkylamino deriváty O-dihydroxybenzenu (adrenalin, noradrenalin a dopamin) - V organismu fungují jako neurotransmitery (nervový systém, mozek) a hormony tvořené dření nadledvin Biosyntéza probíhá v mozku, dřeni nadledvin, extraadrenální chromafinní tkáni a sympatických nervových zakončeních

3. THL L-ADCDBH PNMT Tyrosin → L- DOPA → Dopamin → Noradrenalin → AdrenalinCOMTMAOCOMTMAO COMT 3-methoxytyramin 3-hydroxyfenyloctová Normetanefrin 3,4-dihydroxymandlová Metanefrin kyselina kyselina MAO COMT MAO COMT MAO Homovanilmandlová Vanilmandlová kyselina kyselina Proč se katecholaminy stanovují? - Důvodem sledování je zjištěná souvislost mezi zvýšenou koncentrací katecholaminů a jejich metabolitů v moči a v plazmě a výskytem nádoru feochromocytomu - Feochromocytom sekretuje katechoaminy diagnostické markery - Vědecké studie uvádí vysokou senzitivitu testu stanovení volných metanefrinů vzhledem k feochromocytomu

4. Dieta a odběr vzorku před stanovením Stanovení katecholaminů z plazmy: - Odběr krve nalačno, 2 dny před odběrem omezené užívání určitých léků, nepít kávu a čaj (kofein) - Zavedena kanyla 15 min před odběrem → proplach kanyly heparinem (fyziolog. roztokem) →odběr do odpadní zkumavky→odběr do zkumavky s heparinem nebo EDTA→chlazení ledem→odstředění v chlazené centrifuze→odběr plazmy Stanovení katecholaminů z moči: - 14 dní před sběrem moči omezené užívání léků, 2 dny před sběrem moči nepít kávu, čaj, vyvarovat se alkoholu, citrusových plodů, zeleniny, ořechů a dalších potravin obsahujících látky interferující na chromatogramu, pacient omezí příjem tekutin na max. 2 l - 24 h sběr moči do nádoby obsahující 10 ml 12. 5 % HCl. Nejdříve odběr do odpadu, poté 24h sběr, uchování v chladu

5. Co předchází chromatografickému stanovení? Stanovení katecholaminů z plazmy: - Aplikace plazmy spolu s vnitřním standardem (IS) na Al2O3 sorbent (adsorbce katecholaminů) - Třepání, odstředění, promytí promývacím činidlem (odstranění matrice a nežádoucích příměsí) - Třepání, odstředění, eluce (uvolnění) analytů ze sorbentu elučním činidlem - Aplikace na kolonu HPLC Stanovení katecholaminů z moči: - pH upraveno na 3. 5 - 4, centrifugace, přídavek IS - Automatická dvoukolonová metoda: Nástřik →MFe o vysokém pH → extrakční kolona s obsahem kyseliny fenylborité (zachycení analytů a vyplavení nečistot)→MFe o nízkém pH (eluce) →analytická kolona (separace)

6. HPLC stanovení HPLC = High performance liquid chromatography = Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (též vysokotlaká) - Rozdělení analytů mezi dvě nemísitelné fáze (mobilní /MF/ a stacionární /SF/) na základě fyzikálně-chemických interakcí - MFe protéká konstantní rychlostí systémem, SFe je umístěna v koloně - Rozdělení látek pohybujících se v MFi na jednotlivé zóny podle síly interakce se SFí (eluční křivky - píky) Detektory - měří určitou fyzikálně-chemickou vlastnost závislou na koncentraci - Detektor pro stanovení plazmatických katecholaminů: coulochemický (měří náboj přenesený při elektrochemické reakci) - Detektor pro stanovení močových katecholaminů: fluorescenční (využití přirozené fluorescence sledovaných látek)

7. Chromatogram Chromatogram = chromatografický záznam - výstup z chromatografického systému Počítač převede analogový signál detektoru na digitální výstup ploch píků Standard HMBA Area:62.2791 Pacient s feochromocytomem Area:970.948 HMBA

8. Nestresujte se, ať máte katecholaminy v normě ! Děkuji Vám za pozornost