Pirosekvenēšana

1. Pirosekvenēšana Ance Roga ar10083

2. Vēsture • 1985. Melamede– Pirmo reizi aprakstīts DNS sintēzes reālā laika monitorings – sintēzes sekvenēšanas princips. • 1987.P. Nyre´napraksta kā DNS polimerāzes aktivitāte var tikt monitorēta ar bioluminiscenci • 1988. Hyman- DNS sekvenēšanā izmanto pirofostāta detektēšanu (DNS sekvenēšana, kas neizmanto elektroforēzi, radioaktivitāti vai flourescenci) • 1994... Sekvences detektēšana izmantojot iezīmētus nukleotīdus • 1996. Ronaghi - PCR veidotas DNS materiāla sekvenēšana - dATPαS • 1998. RonaghiM, Uhlen M, Nyren P. Pirosekvenēšanas metode ( Apirāze) • 2000. Ronaghi - ssDNA-bindingprotein • 2004. Roche/454 FLX Pyrosequencer

3. Darbības princips • Pirosekvenēšanas sistēma iekļauj: • 4 enzīmus: DNS polimerāzes I Klenova fragments ATP sulfurilāze Luciferāze Apirāze • Enzīmu substrātus: Adenosīnfosfosulfāts (APS) D – luciferīns • ssDNAsekvenēšanas matrica • Hibridizētspraimeris • 4 nukleotīdi, kas tiek pievienoti vienlaicīgi cikla sākumā • CCD kamera, kas detektē producēto gaismu

4. Enzimātiskās reakcijas

5. Paraugu sagatavošana (Roche/454 sequencer) • 1. genoma fragmentēšana, adapteru ‘piešūšana’ unvienpavedienaDNS iegūšana

6. Paraugu sagatavošana(Roche/454 sequencer) • 2. fragmentu piesaistīšana lodītēm unPCR atsevišķos emulsijas pilieniņos

7. Paraugu sagatavošana(Roche/454 sequencer) • 3. AmplificētāsDNS denaturācija un ievietošana optiska slaida bedrītēs; • Imobilizētu sekvenēšanas fermentu pievienošana

10. + • Liels sekvences nolasījumu skaits vienā reakcijā • Mazākas izmaksas par bāzi (salīdzinot ar Sangera) • Salīdzinoši ātra • Var izmantot barkodu sistēmu, kas ļauj analizēt vienā ranā dažādus paraugus • Neizmanto iezīmētus praimerus, dNTP vai gēla elektroforēzi • Mērījumus veic reālā laikā • Sekvences signāli uzreiz no praimera piesaistīšanās vietas • - • Dārga • Nespēj detektēt garus homopolimērus (5-6 nukleotīdi), kas var novest pie kļūdām • Īsi sekvences lasījumi - filoģenētiskām analīzēm • Var būt apirāzesinhibīcija

11. Pielietojums • Gan zināmām sekvencēm, gan denovo • Mikroorganismu identificēšana • Genotipēšana • Sekundārās DNS struktūras sekvences determinācija • SNP analīze, insercija/delēcijas, kvantificēt alēles • Metagenomika • Transkriptomusekvenēšana • Epiģenētiskās izmaiņas - DNS metilācija

16. Izmantotā literatūra • http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/resource-center/resource-download.aspx?id=7a04a766-e088-4cf9-89ff-c567ba95bb00&lang=en • http://454.com/products/gs-flx-system/index.asp • AfshinAhmadian, MariaEhn, SophiaHober, Pyrosequencing: History, biochemistry and future.ClinicaChimicaActa 363 (2006) 83 – 94 • Elaine R. Mardis, Next-Generation DNA SequencingMethods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008. 9:387–402 • Md. Fakruddin, AbhijitChowdhury, Md. NurHossain, KhanjadaShahnewajBinMannan, ReazMohammadMazumda, Pyrosequencing-PrinciplesAndApplications. International Journal of Life science and Pharma Reviews (IJLPR)Volume 2, Issue 2, Apr-Jun 2012 • Jing-binYan, RongZhang,zCanXiong, ChengHu,zYaoLv, Cong-rongWang, Wei-pingJia, andFanyiZeng, Pyrosequencing Is an Accurate and Reliable Method forthe Analysis of Heteroplasmy of the A3243G Mutation inPatientswithMitochondrialDiabetes. The Journal of Molecular Diagnostics 2014 • Jose´ F. Siqueira, Jr, Ashraf F. FouadandIsabela N. Rocas, Pyrosequencing as a tool for betterunderstandingofhumanmicrobiomes. Journal of Oral Microbiology 2012 • MostafaRonaghi, Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing. GenomeRes. 2001 11: 3-11 • Yoshida S, et al, Rapid identification of strains belonging to the Mycobacterium abscessus group through erm(41)genepyrosequencing, DiagnMicrobiolInfectDis (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2014.04.001

17. Paldies par uzmanību!

18. Kādi ir 4 galvenie enzīmi, kas nepieciešami pirosekvenēšanas sistēmā?