琼脂糖凝胶电泳检测 DNA

1. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

2. 1、仪器设备 电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等

3. 2、琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。

4. 3、胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。

5. 将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。 室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。

6. 4、加样 用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20 l。 DNA Marker: 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的 1 kb DNA ladder（50ng/l ）,或DL2000

7. 5、电泳（带上手套操作） • 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳； • 建议在80～100V的电压下电泳； • 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳； • 将凝胶放入溴化乙啶（EB〕工作液（0.5g/ml左右）中染色约20min。

8. 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。

9. 6、观察与拍照 在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。

10. 对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。

11. DNA Marker 1、 DL2000

12. 2、1 kb DNA Ladder不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大致的量如下（按0.5μg上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：

13. 片段 碱基对 质量 1 10,002 42 ng 2 8,001 42 ng 3 6,001 50 ng 4 5,001 42 ng 5 4,001 33 ng 6 3,001 125 ng 7 2,000 48 ng 8 1,500 36 ng 9 1,000 42 ng 10a 517 42 ng* 10b 500 42 ng*

14. Relaxed circle Super-coiled form

15. 1 2 3 M 学生实验结果 • 未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；3. EcoR1+XhoI双酶切 • M. 1kb DNA Marker.