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ISAIAS LANS VARGAS

Application of Ensemble-Average Transition State Theory with Multidimensional Tunneling to the Study of Hydride Transfer between Anabaena Tyr303Ser FNR and NADP + /H.

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ISAIAS LANS VARGAS

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Presentation Transcript

  1. Application of Ensemble-Average Transition State Theory with Multidimensional Tunneling to the Study of Hydride Transfer between Anabaena Tyr303Ser FNR and NADP+/H Estudio teórico-experimental del mecanismo de transferencia de hidruro entreFerredoxina-NADP reductasa (FNR) de Anabaena y NADP+ ISAIAS LANS VARGAS

  2. Isaias Lans, José Ramón Peregrina y Milagros Medina José M. Lluch, Mireia Garcia-Viloca and Àngels Gonzàlez-Lafont Departament de Química y Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Barcelona), España.

  3. La Cianobacteria Anabaena PCC 7119 FNR 2Fldrd+ NADP+ + H+ 2Fldox + NADPH Citosol Lumen tilacoidal

  4. Mecanismo de transferencia de hidruro Se propone la transferencia neta de hidruro desde el átomo N5 del anillo de Flavina hacia el átomo C4 del anillo de Nicotinamida

  5. Y303 C4 H- N5 ? La transferencia de hidruro entre FNRhq y NADP+ C-III* ¿Tyr303? C-II C-III Y303S C-I Hermoso et al. J. Mol. Biol. 319, 1133-1142 (2002) Nogués et al. Biochemistry 44, 11730-11740 (2005). Bortolotti et al. Biochem. Biophys. Acta-Proteins and Proteomics 1794, 199-210 (2009)

  6. Estudio Experimental Determinar las constantes cinéticas del proceso de transferencia de hidruro y efecto isotópico Estudio Teórico Obtener detalles estructurales del proceso de transferencia de hidruro en FNR (Tyr303Ser) Determinar las constantes de reacción y efecto isotópico del proceso de transferencia de hidruro en FNR (Tyr303Ser) Objetivos Obtener un conocimiento más amplio del mecanismo de transferencia de hidruro al NADP+ catalizado por la FNR (Tyr303Ser). Lo cual podría dar una indicación del papel de la Tyr303 en la FNR nativa Por medio de un estudio teórico-experimental

  7. Resultados Experimentales El equilibrio es desplazado hacia la producción de NADPH El remplazo de Tyr303 por Ser elimina la capacidad de reducción de NADP+ Lans et al. J. Phys. Chem. B.114, 3368-3379 (2010)

  8. Anabaena Tyr303Ser FNR:NADP+ complex 2BSA La Disposición estructural entre la flavina y la nicotinamida en el mutante parece ser adecuada para que se de la transferencia de hidruro en ambas direcciones

  9. Dinámica molecular Términos de Campos de Fuerza más comunes:

  10. H- QM Métodos de mecánica molecular (MM) -No pueden tratar reacciones químicas -Pueden tratar sistemas muy grandes Métodos mecánico-cuánticos (QM) -Pueden tratar reacciones químicas -No pueden tratar sistemas muy grandes QM/MM Parte del sistema más involucrada en la reacción Resto del sistema Parte más alejada del sitio de reacción

  11. Programas Usados CHARMM CHARMMRATE GAUSSIAN

  12. NADP+ Y303 FAD FAD NADP+ A B Estructura cristalográfica de FNR FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)

  13. H- QM Dinámica Molecular QM/MM del complejo Y303S FNR:NADP+ Modelo del Sistema Biológico Equilibrado Centro de reacción en la FNR Campo de fuerza CHARMM22 Dinámica Molecular NPT (270 K, 1 atm) Condiciones de límite periódico Particle Mesh Ewald method. Coordenadas Cartesianas de PDB 2BSA. Estado de protonación: PROPKA. Adición de átomos de H:HBUILD/CHARMM. Neutralización con 7 Na+ Solvatación TPI3P Total número de átomos: 41896 (4800 átomos de proteína) 58 átomos QM; 2 Átomos frontera (GHO); 41838Átomos MM

  14. RD RA Coordenada de reacción (z) = RD- RA Definición de la coordenada de reacción

  15. Nº Conformaciones Wi x Potencial de Fuerza Media (PMF) Muestreo sesgado: umbrella sampling Se Obliga al sistema a explorar zonas de alta energía V´(x) = V(x ) + W(x) Wi(x) = 1/2k(x - xo)2 Para la eliminación del sesgo se hace uso del método WHAM

  16. Potencial de fuerza media (AM1) TS P (CTC-1) R (CTC-2) Proceso endoérgico, con barrera de energía potencial de ~35 kcal/mol

  17. PES de Y303SFNR:NADP AM1 MPWB1K/631g(d,p) AM1 describe mal la contribución de la energía de dispersión al apilamientoy favorece la formación de puentes de hidrógeno MPWB1K/6-31+G(d,p) describe mejor las interacciones de apilamiento que B3LYP(6 kcal/mol de diferencia en energía de formación del complejo) Usando el nivel MPWB1K/6-31+G(d,p)la lumiflavina y 1-metilnicotinamida presentaninteracción de apilamiento. Evaluación del método QM usado

  18. 35.8 kcal/mol 34.9 kcal/mol TS 14.9 kcal/mol P (CTC-1) 3.6 kcal/mol R (CTC-2) Corrección a doble nivel del PMF MPWB1K/631g(d,p) AM1 AM1 Corrección a doble nivel • La corrección de energía con MPWB1K cambia la endoergicidad de la reacción • La localización del estado de transición se desplaza levemente hacia los productos. R (CTC-2) P (CTC-1) Lans et al. J. Phys. Chem. B.114, 3368-3379 (2010)

  19. Interacción del centro de reacción con la proteína

  20. TS R (CTC-2) α = 10º α = 60º H H H H N5 C4 C4 N5 β=120ºβ=170º Variación del ángulo entre los anillos de flavina y nicotinamida en la reacción TS P (CTC-1) R (CTC-2) + - • El ángulo N5 – hidruro – C4N se aproxima a 180º y el átomo aceptor y donador se aproximan entre sí. • Deformación del par iónico FNRrd-NADP+, y pérdida parcial de la interacción de apilamiento π • La penalización energética incrementa el costo energético del estado de transición Lans et al. J. Phys. Chem. B.114, 3368-3379 (2010)

  21. Corrección vibracional

  22. Vi(s) Para cada configuración i. Coordenada de reacción z PMF H/D

  23. Z2 Z1 R SP P Coeficiente de transmisión neto promedio γ Por cada configuración de estado de transición vibracional i a z*QC: Aproximación a zona secundaria estática (Frozen Bath) • AM1/CHARMM22 SP localización • AM1/CHARMM22MEP • Corrección a doble nivel del MEP • (interpolación usando ISPE). • 4) Factor de transmisión Quasiclásico Γi • 5) Coeficiente de transmisión Semiclásico κi

  24. Coeficiente de Transmisión Coeficiente de Transmisión: P(E) : permeabilidad (o probabilidad de transmisión):

  25. i(T) = exp{-DGi} Vi(s) Para cada configuración i. DDGi PMF tunel I(T) Coordenada de reacción z Cálculo del Coeficiente de Transmisión: γ 8 estructuras optimizadas TS P R

  26. Cálculo de la constante de reacción Lans et al. J. Phys. Chem. B.114, 3368-3379 (2010)

  27. Comparación Teórico Experimental Lans et al. J. Phys. Chem. B.114, 3368-3379 (2010)

  28. Conclusiones • La transferencia de hidruro en la dirección fisiológica desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ no es posible. Sin embargo, la reacción inversa, la transferencia de hidruro de NADPH hacia Tyr303Ser FNRox, ocurre. • Las constantes de reacción teórica y experimental están en concordancia. • En la zona de reactivos la distancia N5-C4N es compatible con la transferencia de hidruro, pero el ángulo entre los átomos N5-hidruro-C4N no es colineal, y por lo tanto, la transferencia de hidruro es ineficiente. • La transferencia de hidruro involucra una importante cantidad de efecto Túnel. • Las deformaciones geométricas que incluyen pérdida parcial de interacción de apilamiento πinvolucran una gran penalización de energía libre para poder alcanzar el estado de transición.

  29. α = 10º α = 60º H H H H N5 C4 C4 N5 Posible papel de Tyr303 en WT FNR WT FNR Cualquier factor capaz de romper la interacción de apilamiento entre el par iónico FADH-:NADP+ podría desestabilizar los reactivos, incrementando la constante de reacción.

  30. AGRADECIMIENTOS Grupo de Biología Estructural Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Universidad de Zaragoza Prof. Dra. Milagros Medina Prof. Dr. Carlos Gómez-Moreno Dra. Marta Martínez Dra. Patricia Ferreira Dra. Susana Frago José Ramón Peregrina Guillermina Goñi Ana Serrano Beatriz Herguedas Ana Sánchez Raquel Villanueva Departament de Química Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Dr. José M. Lluch, Dra. Mireia Garcia-Viloca Dra. Àngels Gonzàlez-Lafont

  31. Grupo de interacción proteína- proteína y transferencia de electrones (UZ)

  32. Gracias por su atención

  33. Corrección vibracional H Corrección vibracional D E(kcal/mol) z z Ajuste a una curva gaussiana Corrección Vibracional

  34. NADP+ Y303 FAD FAD NADP+ A B E1 E2 E3 Simulación NT FNR:NADP FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA) Hipótesis del mecanismo de reconocimiento del NADP+ en la FNR

  35. Weighted Histogra Analysis Method (WHAM)

  36. Modelo de partida para la simulación del complejo NT FNR:NADP+.

  37. Dinámica Molecular con restricción del movimiento de FADH- y NAD+ Dinámica Molecular con la restricción del movimiento de la Arg 264 Simulación del complejo FNR:NADP+ Equilibrado del Modelo

  38. R264 Fluctuación de residuos de FNR durante la dinámica molecular

  39. 24kcal/mol V(kcal/mol) Z(Å) PES partiendo del modelo de WT N1-C4N N10 N1N Plantilla Y303SER

  40. pKa Glu301: 5.11 pKa Glu301: 8.04 V(kcal/mol) W(kcal/mol) Z(Å) Z(Å) Corrección a doble nivel del PMF WT

  41. 75kcal/mol PES con Glu301 protonado

  42. 35kcal/mol PES partiendo de reubicación de TYR

  43. Modelos de FNR WT obtenidos con el servidor Geno3D Plantilla: estructura de FNR PDB (1qga)

  44. PES partiendo de un modelo obtenido usando el servidor Geno3D 25kcal/mol Plantilla: estructura de FNR de guisante

  45. Glu301 QN NEUTRA SQ NEUTRA HQ ANIÓNICA Puntos a tener en cuenta para la simulación de la FNR WT Ser80

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