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第五章 中医细胞生物学 实验研究. 本章的教学目的和要求： 1 ．掌握细胞生物学的基本概念及内容。包括细胞的基本结构与功能、细胞的增殖与分化、细胞的衰老与死亡。 2 ．掌握细胞培养的概念和方法。 3 ．掌握中药血清药理学的概念和方法。 4 ．了解细胞生物学的其它常用研究技术。包括显微镜技术、细胞化学技术、细胞周期分析、细胞凋亡的测定、细胞结构成分的离心分离技术、分子生物学技术等。 5 ．了解细胞生物学技术在中医研究中应用的现状。. 细胞生物学 是从细胞、亚细胞和分子 3 个水平研究细胞生命活动的学科。
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第五章 中医细胞生物学 实验研究
本章的教学目的和要求： 1．掌握细胞生物学的基本概念及内容。包括细胞的基本结构与功能、细胞的增殖与分化、细胞的衰老与死亡。 2．掌握细胞培养的概念和方法。 3．掌握中药血清药理学的概念和方法。 4．了解细胞生物学的其它常用研究技术。包括显微镜技术、细胞化学技术、细胞周期分析、细胞凋亡的测定、细胞结构成分的离心分离技术、分子生物学技术等。 5．了解细胞生物学技术在中医研究中应用的现状。
细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子3个水平研究细胞生命活动的学科。细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子3个水平研究细胞生命活动的学科。 细胞生物学研究内容广泛，主要包括：① 细胞的结构和化学组成。② 细胞及细胞器的功能。③ 细胞的增殖与分化。④ 细胞的衰老与死亡等。
细胞生物学技术：包括形态学观察技术、细胞化学技术、分析细胞学技术、细胞培养和细胞融合技术等。细胞生物学技术：包括形态学观察技术、细胞化学技术、分析细胞学技术、细胞培养和细胞融合技术等。 与细胞生物学相关的概念： 体外实验：又称离体实验，指脱离机体的组织、细胞实验。 体内实验：又称整体实验，指人体或动物的实验。
中医药研究能不能采用细胞生物学技术？ 有人认为不可以。依据：不是整体。如何望闻问切四诊、如何辨证、如何体现整体观、如何用药？ 也有人认为可以。 大家如何看这个问题？ 请看两个案例：
1．二仙汤作用机制的研究 在我国，中医药在妇女围绝经期综合征防治方面发挥着重要的作用，并形成了一些代表性临床有效方剂，例如二仙汤（淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、知母、黄柏）。以往的系列实验研究发现二仙汤具有延缓老年大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的衰老，并具有增进其功能的作用。 问题： 二仙汤是直接作用于下丘脑、垂体，还是性腺呢？ 是哪些中药或有效成分在起作用？
最好的办法是采用细胞生物学技术，将性腺等有关细胞，体外用药、培养观察，以排除体内性腺轴等其他组织的影响。最好的办法是采用细胞生物学技术，将性腺等有关细胞，体外用药、培养观察，以排除体内性腺轴等其他组织的影响。 可以采用拆方、单味中药，甚至是中药的主要成分实验，筛选其主要作用部位和配伍。后者是中药发展的重要趋势。
以下数据引自董冰峰硕士学位课题的实验记录：以下数据引自董冰峰硕士学位课题的实验记录： （1）不同浓度二仙汤全方及拆方直接加入对原代培养大鼠卵泡颗粒细胞分泌雌二醇（E2）的作用 方法：于24孔培养板中培养原代培养的大鼠卵泡颗粒细胞，每组4孔。将二仙汤全方和温肾、滋阴两个拆方分别稀释100倍和1000倍（在图中分别以-2、-3表示），设空白对照组。给药培养24小时后，吸取上清液，采用放射免疫分析方法测定E2。
结果：稀释1000倍的温肾组作用最好，与空白对照组比较，有显著性差异。结果：稀释1000倍的温肾组作用最好，与空白对照组比较，有显著性差异。 二仙汤全方及拆方不同浓度直接加入对颗粒细胞分泌E2的作用 分析：拆方以温肾方（淫羊藿、仙茅、巴戟天）为好，是哪味中药有效呢？还是均有效呢？ ＊ ┌─────────┐
（2）二仙汤各单味药直接给药对原代培养卵泡颗粒细胞分泌E2的作用（2）二仙汤各单味药直接给药对原代培养卵泡颗粒细胞分泌E2的作用 方法：按以上方法，将二仙汤全方中的每一味药单独用M199细胞培养液稀释1000倍，直接加入，空白对照组仅用M199细胞培养液。给药培养24小时后，吸出上清液，测E2含量。
结果：二仙汤全方中每一味药均可不同程度促进卵泡颗粒细胞分泌E2。温肾方的3味中药仙茅、巴戟天和淫羊藿与空白对照组相比，均可以显著提高颗粒细胞分泌E2；滋阴组两味中药知母和黄柏作用弱；当归对刺激E2分泌也有较显著的促进作用。结果：二仙汤全方中每一味药均可不同程度促进卵泡颗粒细胞分泌E2。温肾方的3味中药仙茅、巴戟天和淫羊藿与空白对照组相比，均可以显著提高颗粒细胞分泌E2；滋阴组两味中药知母和黄柏作用弱；当归对刺激E2分泌也有较显著的促进作用。 中药直接加入对卵泡颗粒细胞分泌E2的作用 ＊ ┌────┐ ＊ ┌───────┐ ＊ ┌──────────┐ ＊ ┌──┐
（3）个别中药成分直接给药对原代培养卵泡颗粒细胞分泌E2的作用（3）个别中药成分直接给药对原代培养卵泡颗粒细胞分泌E2的作用 方法：按以上方法，仙茅苷（仙茅的主要成分）和淫羊藿苷（淫羊藿的主要成分）用DMSO溶解后，加入M199培养基，过滤灭菌。两者浓度分别为100μg/L（仙茅1、淫羊1）、300μg/L （仙茅2、淫羊2）。大鼠卵巢颗粒细胞达到贴壁伸展的状态后，直接加入含有中药有效成分的培养基0.5ml，继续培养3小时。吸取上清液，置-20℃冰箱终止反应，测E2含量。
结果：300μg/L浓度的淫羊藿苷（淫羊2）具有促进卵泡颗粒细胞分泌E2的作用。两个浓度的仙茅苷、及低浓度的淫羊藿苷无作用。结果：300μg/L浓度的淫羊藿苷（淫羊2）具有促进卵泡颗粒细胞分泌E2的作用。两个浓度的仙茅苷、及低浓度的淫羊藿苷无作用。 部分中药成分直接给药对卵泡颗粒细胞分泌E2的作用 分析：（1）淫羊藿促进卵巢颗粒细胞分泌E2的作用，可能是淫羊藿苷的作用。（2）仙茅苷无效的原因有待分析。（3）鉴于原代细胞质量控制的困难，希望采用卵巢颗粒细胞株代替。 ＊ ┌─────────────┐
2．细胞角蛋白18在肝癌中的作用 细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）在大鼠肝脏中的特点是表达量较大，应具有较大的生理（或病理）功能。该基因在DEN诱癌期间几乎是持续上调，至肝癌形成之际处于较高的表达水平。当肝癌发生后CK18上调近3倍，中药不同治法对其下调的作用不明显，其中健脾益气法具有轻微地下调作用，其他治法，尤其是对照西药，反而上调该基因的表达。
上图 CK18在DEN诱导大鼠肝癌不同阶段的表达 下图 不同治法对大鼠肝癌CK18的作用
以往研究发现，CK18的1型中级细丝链由KRT18基因所编码，表达于单层上皮细胞组织，其突变与原因不明的肝硬化或硬化证有关。以往研究发现，CK18的1型中级细丝链由KRT18基因所编码，表达于单层上皮细胞组织，其突变与原因不明的肝硬化或硬化证有关。 还有研究观察到，人肝癌组蛋白3与CK18发生免疫共沉淀，推测组蛋白3的表达与细胞角蛋白18改变高度相关，并在肝癌的发生中发挥重要的作用。
问题： 该基因在肝癌的发生与发展中扮演着什么样的角色？ 中医健脾益气治法下调该基因的药理意义如何？ 有没有可能筛选和优化中医药防治肝癌的方法？ 即如果该基因在肝癌的发生中确有重要的作用，可以将此基因作为疗效评价指标之一，用于筛选具有防治肝癌的中药，不断优化中药的配伍及有效成分的配伍。
如何回答以上的问题？ 方法之一，是在肝癌细胞中把该基因关闭掉，或者令其表达后沉默，不能翻译成蛋白。如果该基因表达沉默后，肝癌细胞的增殖受到抑制，则表明肝癌细胞的增殖依赖该基因，亦即该基因具有促进肝癌细胞恶性增殖的作用（角色）。 方法：采用RNA干扰技术。该技术需借助细胞生物学实验。
上图 高浓度肝癌细胞CK18 RNAi后生长曲线 下图 低浓度肝癌细胞CK18 RNAi后生长曲线 * 图中正电高/中代表经空白电击后高、中两个浓度的肝癌细胞；阴性高/中代表电转染RNAi空白载体；CK18高/中代表电转染CK18的RNAi载体。
分析：CK18似有促进肝癌细胞恶性增殖的作用。当CK18表达沉默后，可进一步检测组蛋白3表达水平是否下降；并可进一步观察其与其他基因表达的关系。分析：CK18似有促进肝癌细胞恶性增殖的作用。当CK18表达沉默后，可进一步检测组蛋白3表达水平是否下降；并可进一步观察其与其他基因表达的关系。 结论：当代的中医药研究，需要回答许多深层次的学术问题，已不仅仅是传统的临床或动物药理实验。中医药研究需要不断深入的探索和创新，由此要求不断引入新技术、新方法、新思路，其中就包含了细胞生物学技术。
在座的同学有开展过探索性实验的，结果如何？是不是可以采用细胞生物学技术进一步深入研究呢？在座的同学有开展过探索性实验的，结果如何？是不是可以采用细胞生物学技术进一步深入研究呢？ 比如进一步观察和确认某中药复方有没有作用？哪些组合、配伍、药物有效？药物的有效部位、成分、及其组合如何？被调控的组织、系统、器官是什么？被调控的基因、基因组是什么？如何提高疗效……
归纳细胞生物学技术的特点： 细胞生物学技术的优缺点：
第一节 细胞生物学的基本理论 细胞分为原核细胞与真核细胞。 原核细胞结构简单，仅由细胞膜包绕，在细胞质内含有DNA区域，但无被膜包围。其细胞质中没有内质网、高尔基复合体、溶酶体及线粒体等膜性细胞器，但含有核糖体。其另一特点是在细胞膜外，有一坚韧的细胞壁，其主要成分是蛋白多糖和糖脂。常见的原核细胞有支原体、细菌、放线菌和蓝绿藻等，在医学研究中，常用的大肠杆菌即属于原核细胞。 真核细胞 比原核细胞进化程度高，结构更复杂，有核膜包围的细胞核。 细胞生物学通常指真核细胞。
一、细胞的基本结构与功能 光学显微镜可见显微结构，电子显微镜可见亚显微结构。 真核细胞可分为细胞膜、细胞质（可见各种膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、溶酶体、线粒体、过氧化物酶体，以及微丝、微管、中等纤维等细胞骨架系统）和细胞核（可见核仁、染色质、核骨架）。
1．生物膜结构及其功能 2．细胞骨架结构及其功能 3．细胞质溶胶及其功能 4．细胞核及其功能 动物细胞的结构
二、细胞的增殖与分化 细胞增殖是指细胞的不断生长与分裂，与细胞周期调控有关。 细胞周期是指细胞从上一次分裂结束开始生长到下一次分裂终了所经历的过程，其所需的时间则称为细胞周期时间。
细胞周期： （1）分裂期（M期）：细胞有丝分裂的过程。 （2）分裂间期： 1）DNA合成前期（G1期，又称有丝分裂后期，是调节下一轮周期时间的关键） 2）DNA合成期（S期） 细胞周期 3）DNA合成后期（G2期，介于S期与M期之间，时间短）。 4）暂不增殖细胞（G0细胞）：一般情况下是不分裂，如神经、肌肉、肝、肾细胞等。
周期性细胞：细胞周期中连续分裂的细胞，如生理状态下的上皮基底层细胞与部分骨髓细胞、肿瘤细胞等。周期性细胞：细胞周期中连续分裂的细胞，如生理状态下的上皮基底层细胞与部分骨髓细胞、肿瘤细胞等。 细胞周期的过程是严格有序的，其调控是一个极其复杂的过程。 细胞分化：指从受精开始的个体发育过程中细胞之间逐渐产生稳定性差异的过程。细胞分化使细胞由非专一性（非特化性）状态向形态和功能的专一性（特化性）状态转变，成为具有不同表型结构的各种类型的细胞。 细胞分化的调控是一个十分复杂的过程。
三、细胞的衰老与死亡 细胞衰老的特征：① 细胞内水分减少，导致细胞硬度增加，代谢速率减慢。② 色素颗粒沉积。③ 细胞器的衰老变化，包括细胞膜上的微绒毛数目增加，细胞膜的流动性降低，线粒体的数量减少而体积增大，细胞核核膜内折。④ 化学组成与生化反应的改变，如蛋白质合成的速度下降，细胞内酶的活性与含量发生变化。 按细胞死亡的特点，可大致分为两大类：
细胞凋亡：即程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主有序的一种生理性细胞死亡，以细胞DNA早期降解为特征的、无明显细胞溶解的细胞自杀过程。细胞凋亡：即程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主有序的一种生理性细胞死亡，以细胞DNA早期降解为特征的、无明显细胞溶解的细胞自杀过程。 细胞坏死：即细胞病理性死亡。 细胞凋亡与细胞坏死的形态学区别
正常胸腺细胞 凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）
第二节 细胞生物学常用实验技术 一、细胞培养技术 细胞培养技术是细胞体外培养的实验技术，分原代培养和传代培养。 培养的植物细胞团
原代培养：指来自于供体的组织或细胞在体外进行的首次培养，其培养细胞的主要特点是生物学特性与在体细胞最为接近。原代培养：指来自于供体的组织或细胞在体外进行的首次培养，其培养细胞的主要特点是生物学特性与在体细胞最为接近。 大鼠超排卵卵巢组织形态与正常组织 卵泡颗粒细胞培养72小时 1 PMSG刺激后的大鼠双侧卵巢； 2 正常大鼠双侧卵巢。——引自董冰峰硕士毕业论文
常用的原代培养方法主要有组织块法和消化法：常用的原代培养方法主要有组织块法和消化法： 组织块法：将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块，接种于培养瓶中，新生的细胞大约在24h后可从贴壁的组织块四周游离出来，并继续生长。 消化法：指应用胰蛋白酶、胶原酶、DETA等生化的手段将已剪切成较小体积的组织块中妨碍细胞生长的基质、纤维等间质加以消化，使组织中结合紧密的细胞相互分离，从而形成含单细胞或细胞团的悬液，进一步培养后，便可生长出大量活细胞。
传代培养：指细胞在培养过程中，对细胞加以及时的分离、稀释，继续培养。传代培养：指细胞在培养过程中，对细胞加以及时的分离、稀释，继续培养。 根据细胞在培养瓶中的生长方式，可分为：贴壁细胞和悬浮细胞。对于大多数贴壁细胞，主要采用0.25%胰蛋白酶液消化后稀释的方法进行传代。 垂体细胞前叶细胞培养24小时 垂体细胞前叶细胞培养72小时
1．细胞体外培养的一般条件 培养细胞一般接种于盛有pH 7.2～7.4的培养液的器皿中，放置在36～37℃、5%CO2加95%空气混合气体、95％～100%湿度的培养箱中。这种环境同样也适合多种细菌、支原体、真菌的生长。因此，通常在培养液中加入适量的抗生素（如青霉素、链霉素），并在细胞培养的全过程保持无菌操作。 CO2培养箱
细胞需要生长在具有充分营养物质的培养基中，培养基主要含有的成分有：① 含氮化合物；② 维生素和某些金属离子；③ 无机盐离子；④ 碳水化合物；⑤ 促生长因子。目前细胞培养的培养基已商品化生产。另外，大多数细胞的培养液中需加入血清，常用经56℃、30min灭活的胎牛血清、小牛血清，血清中含有多种细胞生长因子、促贴附因子以及其他生物活性物质。培养液中血清的含量一般为10%，以维持细胞的正常生长。
培 养 板 培养瓶 培养皿
2．细胞的冻存与复苏为了对以扩增细胞的保种，以及实验结束后细胞的长期存放，要求对体外培养的细胞及时冻存。冻存通常是指将细胞混悬在培养液中，加入适量的二甲亚砜（DMSO）或甘油后，冷冻储存在-196℃的液氮中。在细胞冻存过程中要注意采用缓慢冻存的方式，通常采用以下条件逐步冻存：首先将装细胞的冻存管置于4℃冰箱1h，再置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃冰箱2h，最后置于液氮长期保存。2．细胞的冻存与复苏为了对以扩增细胞的保种，以及实验结束后细胞的长期存放，要求对体外培养的细胞及时冻存。冻存通常是指将细胞混悬在培养液中，加入适量的二甲亚砜（DMSO）或甘油后，冷冻储存在-196℃的液氮中。在细胞冻存过程中要注意采用缓慢冻存的方式，通常采用以下条件逐步冻存：首先将装细胞的冻存管置于4℃冰箱1h，再置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃冰箱2h，最后置于液氮长期保存。 复苏是指将-196℃液氮中冻存的细胞取出融解，使其活力恢复的过程。在细胞复苏过程中，要注意采用快速融化的方式，通常将装细胞的冻存管直接从液氮中取出放置于37℃水浴中，并不断摇晃，使冻存的细胞悬液尽快融化。
3．培养细胞的生长与观察医学上培养的细胞大多为贴壁细胞，贴壁细胞刚接种入培养液时多呈圆球形，几十分钟至数小时后，贴附到瓶壁上，此称为细胞贴壁。细胞一经贴壁就迅速铺展呈多形态，经过一段潜伏期后细胞即开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般在数天内就铺满瓶壁，形成致密的细胞单层。对数生长期是细胞活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的、最主要的阶段。3．培养细胞的生长与观察医学上培养的细胞大多为贴壁细胞，贴壁细胞刚接种入培养液时多呈圆球形，几十分钟至数小时后，贴附到瓶壁上，此称为细胞贴壁。细胞一经贴壁就迅速铺展呈多形态，经过一段潜伏期后细胞即开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般在数天内就铺满瓶壁，形成致密的细胞单层。对数生长期是细胞活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的、最主要的阶段。 长成单层的细胞经过一段时间，一定要进行细胞的传代。传代后的细胞在新的培养瓶中约经6～24h开始贴壁，再次进入新的生长周期。细胞系在体外的可传代数与细胞种类及供体的年龄等有关。
细胞培养中的一个非常有趣的现象是细胞的接触抑制，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，相互紧密接触的细胞不再进入S期（一些肿瘤细胞例外）。细胞培养中的一个非常有趣的现象是细胞的接触抑制，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，相互紧密接触的细胞不再进入S期（一些肿瘤细胞例外）。 肝癌QGY-7703细胞400× 肺癌细胞100× 肝癌细胞有接触抑制现象。 肺癌细胞则没有接触抑制现象。
人胚肺二倍体成纤维细胞在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡；神经元一般不能传代培养，正常肝细胞及肾细胞也仅能传几代或十几代，而大多数肿瘤细胞株的传代要多得多。人胚肺二倍体成纤维细胞在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡；神经元一般不能传代培养，正常肝细胞及肾细胞也仅能传几代或十几代，而大多数肿瘤细胞株的传代要多得多。 细胞系：传代培养的原代细胞。 细胞株：细胞系由单细胞分离培养、增殖形成细胞群。 体外培养的细胞形态，与体内原有细胞不同，按形态大致可分为成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。
细胞进行生长增殖能力的测定：MTT法最常用。MTT的化学名称为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，其可接收氢原子而发生显色反应。活细胞中的线粒体具有琥珀酸脱氢酶，能够使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜中，应用酶标仪在570nm波长可以检测其光吸收值，并根据吸收值的高低判断细胞数量。细胞进行生长增殖能力的测定：MTT法最常用。MTT的化学名称为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，其可接收氢原子而发生显色反应。活细胞中的线粒体具有琥珀酸脱氢酶，能够使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜中，应用酶标仪在570nm波长可以检测其光吸收值，并根据吸收值的高低判断细胞数量。 MTT显色前后 台式摇床 酶标仪
