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微生物实验常用技术

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微生物实验常用技术. 何平 病原生物学教研室. 常用的体外微生物实验技术。 常用的体内微生物实验技术。. 常用的体外微生物实验技术. DNA recombination DNA 重组 SSH 抑制性 消减杂交 Microarray 基因芯片 新一代测序技术在表达谱分析分析上的应用. DNA 重组. 同源重组 ( homologous recombination ) 非同源重组 ( no homologous recombination ): 位点特异性重组 ( site-specific recombination )

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微生物实验常用技术

何平

病原生物学教研室

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常用的体外微生物实验技术。
  • 常用的体内微生物实验技术。
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常用的体外微生物实验技术

  • DNA recombination DNA 重组
  • SSH 抑制性消减杂交
  • Microarray基因芯片
  • 新一代测序技术在表达谱分析分析上的应用
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DNA 重组
  • 同源重组(homologous recombination)
  • 非同源重组(no homologous recombination):

位点特异性重组(site-specific recombination)

转座重组(transposition recombination)

异常重组(illegitimate recombination)

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同源重组的机制
  • Holliday模式
  • 单链发生切割产生缺刻
  • 切割链与对方互补链配对
  • 缺刻被封闭,两条DNA双链形成铰链分子。
  • 形成异源双链区
  • 重组中间体形成
  • 在铰链处的另一条链上发生切割。
  • 形成重组DNA分子
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SSH 抑制性消减杂交
  • SSH(Suppression subtractive hybridization)
  • 什么是SSH,原理
  • SSH的历史,发展与现状
  • 微生物研究中的应用
  • 优缺点
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问题
  • 不同菌株间毒力不同
  • 病原体在体内,外表达的不同
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解决方法
  • 测序
  • 基因芯片,蛋白芯片
  • SSH
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什么是SSH
  • SH, 1990,首次用于微生物研究:

野生株酵母与变异株酵母进行消减杂交

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SSH
  • 1996,Diatchenko在SH基础上进一步改善技术
  • 1998年第一次用于研究细菌幽门螺杆菌
  • 现可以买到Clontech PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit的试剂盒现可以买到Clontech PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit的试剂盒
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adapter 1 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’

3’-CCCGTCCA-5’

adapter 2 5’-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3’

3’-GCCTCCCGCCA-5’

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SSH在微生物研究中的应用
  • 检测毒力岛,寻找毒力有关基因
  • 不同菌株的表达不同,及同一菌株在不同环境下表达的不同
  • 可移动的遗传因子的变化
  • 检测的探针
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SSH技术的缺陷
  • 表达量很低的差异mRNA也很难被扩增。所以一些量少的基因不作为SSH的检测对象,如转录因子,细胞因子,受体等。
  • 要检测出表达量的不同要高于5倍才行。
  • 一些重要的差异基因可能会漏过。
  • SH无法将两个菌的不同基因都测出,得到的产物不全是差异基因。要考虑用其他技术补充。
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应用:
  • 微生物比较基因组学研究

e.g. E.coli

Distribution of deletions among strains of E.coli

Ref: Ochman H & Jone IB. EMBO J,2000;19:6637-6643.

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微生物基因表达谱研究

e.g.

Species Experimental design Reference

H.pylori NTU-D1 PH 5.5 versus PH 7.2 Ang S ,et al.(2000)

E.coli K-12,MG1655 oxidative stress,H2O2 Zheng M, et al.(2001)

E.coli K-12,MG1655glucose versus acetate Oh MK, et al.(2002)

B.burgdorferi Rat, peritoneal cavity Revel AT,et al.(2002)

……

  • 微生物检测鉴定研究

e.g.通用检测芯片 耐药性检测芯片

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问号钩体基因组DNA芯片的研制

♦问号钩体基因组DNA芯片的制备

引物设计

靶序列的制备

点样

♦问号钩体基因组DNA芯片的应用

钩体比较基因组研究(CGH)

钩体转录组研究

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Query ORF

Blast search

homologous

Blast hits

unique

……

Dynamic programming

Sequence pool

Output

Global alignment

Gapless alignment

TGATTTCACTA

Primer3

CTAAGCTATCC

Gene-specific fragments

……

Primers

引物设计
  • PRIMEGENS进行引物设计的原则

Ref: Xu D, Li GS, Xu L, et al. Bioinformatics,2002;18(11):1432-1437.

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引物设计的参数及输出结果
  • 参数
  • 引物长度18bp-24bp
  • GC含量35-60%,并具有较为一致的Tm(55℃±3℃)
  • 最小形成发夹结构及二级结构的可能性
  • 产物长度250bp-1200bp
  • Blast的参数:simmax=0.75; lmin=100nt;Emax=10-15
  • 引物设计输出结果
  • 正向、反向引物
    • 起始位置
    • 终止位置
    • 退火温度
  • 产物长度
  • 目的基因长度
  • 特异性片断的长度
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靶序列的制备
  • PCR反应条件

100µl反应体系:

10mM Tris-HCl (pH 8.0)

50mM KCl

2.5mM MgCl2

0.2mM dATP、dCTP 、dGTP、dTTP

3 U Taq DNA聚合酶

引物各10pmol

20ng模板DNA

  • PCR反应结果

对于问号钩体赖型赖株(#56601)的 3512个ORF(序列长度>250bp),共成功设计3300对引物。经二轮PCR反应及重新设计引物后共扩增出3290个产物。

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PCR产物纯化后的部分电泳图

PCR产物纯化后的部分电泳图(1-48为PCR产物;M为DNA Marker DL2000)

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点样
  • 384板组板
  • 现有3290条PCR扩增产物,组成9块384板。
  • 对照样品独立组成1块384板,包括1个定位点,19个阳性对照点 及10个阴性对照点。

共10块384板。

  • 点阵排布
  • 芯片点样仪为Genemachine,点样针为狭缝针,片基采用氨基化玻片。
  • 所有样品排布于 12个亚矩阵中,且每张芯片上重复点样三次。
  • 亚矩阵:由18×18的点阵组成。
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问号钩体基因组DNA芯片的组成

  • 钩体赖株在GenBank中共注释了4727个基因,钩体DNA芯片上共包含了3528个ORFs,每个ORF在芯片上有三个重复。每张芯片还包含了相应的阳性对照点(钩端螺旋体代谢相关基因)及阴性对照点(棉花和人的基因)。
56601 dna cy3
参考株#56601菌DNA标Cy3的单色自身杂交图

亚矩阵1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

重复1

重复2

重复3

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(一)探针标记和芯片杂交

  • 钩体28℃培养至对数生长期
  • 抽DNA,进行荧光标记
    • Reference: 赖株
    • Sample:其他检测株钩体
  • 每个检测株钩体进行2次芯片杂交,第一次Sample标记Cy3; Reference标记Cy5。第二次标记相反。
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检测株澳洲型65-9株DNA标Cy3 +参照株赖株DNA标Cy5的杂交图

检测株澳洲型65-9株DNA标Cy5 +参照株赖株DNA标Cy3的杂交图

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(二)数据分析

  • 芯片上荧光的信号强度用 Genespring software 4.0的中值法进行归一化处理。
  • 用Excel软件计算各信号点上检测株与参照株比值,即S/R ratio值。每个ORF取3个ratio值的中值作为最终ratio值。两次实验中log2 ratio值均小于cutoff值时作为缺失基因。
  • 去除无效点:

FLaiMedian-BLaiMedian-2×BLaiSD <0

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(三)确定cutoff值

  • 以中赖各基因为提问序列,与Fiocruz L1-130株全基因组序列进行blastN,取分值最高区域并计算H值。

H value:[(length of highest-score region) ×(identities )] / (length of query sequence)

  • 如比较结果中没有E值小于0.01的同源序列,H值设为0。
  • 根据H值和赖株与Fiocruz L1-130株杂交结果来确定cutoff值。
slide38
在利用基因组DNA芯片进行比较基因组学研究时,首先要确定基因缺失的筛选标准-cutoff值。在利用基因组DNA芯片进行比较基因组学研究时,首先要确定基因缺失的筛选标准-cutoff值。
  • 确定cutoff值最常用的方法是选取已完成全基因组测序且在遗传学上与制备芯片的参考菌株相近的某一菌株作为待测菌,用blast和芯片杂交法分别预测待测菌相对于参考菌所缺失的基因。通过比较两种方法的结果,来确定cutoff值。
  • 2003年问号钩体Fiocruz L1-130株在巴西完成测序。
slide40
取cutoff值为-1.585。
  • 假阴性为0(0/3131),假阳性为3.3%(2/61)。
  • 两次实验S/R(检测/参照) ratio均0.33的基因作为在检测株中缺失/非保守基因。
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(四)芯片杂交结果
  • 有275个基因在11个检测菌中至少有一株菌中缺失,占芯片中所有ORF的7.9% 。
  • 2,917个基因在所有检测菌中均保守 。
28 37
问号钩体赖型在28℃和37℃两种不同的体外培养温度下基因转录情况的变化问号钩体赖型在28℃和37℃两种不同的体外培养温度下基因转录情况的变化
  • 问号钩体在28℃和37℃培养至对数生长期后提取RNA,分别用Cy5和Cy3标记并与芯片杂交,并重新抽提RNA重复实验一次。
  • 根据通用筛选标准(ratio*值>2者或<0.5为表达上调或下调的基因)进行统计,取两次重复都发生相同变化的基因进行统计,结果表明问号钩体在两种不同的培养温度约有3.5%基因的转录情况发生了较显著的变化。
microarray
Microarray 特点
  • 规模化检测
  • PCR基础的microarray 不能检测到点突变和嵌合基因
  • 存在一定假阳性率和假阴性率,需用其他方式验证
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新一代测序技术在表达谱分析分析上的应用
  • Solexa测序服务采用Illumina Genome Analyzer系统。
  • SOLiDTM 3 系统是由AB公司研发的新一代超高通量基因测序分析系统,可运用到多个领域。
illumina s solexa sequencing technology
Illumina\'s Solexa Sequencing Technology
  • Solexa测序技术采用大规模并行合成测序法(SBS, sequencing-by-synthesis),可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究。
  • 大大降低了测序成本,同时提高了测序效率;
  • 每个flow cell有8个通道,每个通道可单独运行一个样品,也可以把多个样品混合在一起检测;
  • 一次单通道的测序可以获取至少500万个读数
  • 每次运行实验可读取10亿个碱基/flow cell 
  • 可精确读取重复序列;
  • 无需建库,自动化样品制备,简单,成本低;
  • 样本使用效率极高,所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测
  • 每次测序长度为30 bp左右 
solexa
Solexa测序采用怎样的测序流程?
  • 以small RNA测序为例。从总RNA样品中分离出small RNA (smRNA),在smRNA的两端分别连接接头(adapter)。对带有接头的smRNA进行RT-PCR扩增,将回收的目的片段结合至表面带有单链引物的专利芯片(flow cell)上,并进行“桥式”扩增(Bridge Amplification),获取大量的“簇群”(Clusters)。以该簇群为模板,采用可靠的Sequencing-by-Synthesis (SBS)技术,并引入Reversible Terminators With Removable Fluorescence策略进行序列的高准确度测定。
solexa1
Solexa测序与传统的测序相比有哪些优势?
  • 1.超高通量:每次配对末端运行后可以得到超过3Gb的高品质过滤数据。
  • 2.需要样品量少:需要的样品量低至100ng,
  • 3.简单、快速、自动化。
  • 4.创新的测序技术:Genome Analyzer采用Sequenciong-by-Synthesis (SBS)技术和Reversible Terminators With Removable Fluorescence策略,可进行大规模并行测序,同时获取高精确度的测序结果。
  • 5.精读范围大:可精读18nt以上的重复序列。
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Solexa测序的读长为30nt左右。
  • 每条通道至少500万个读数(read)。
  • 每个flow cell含有8个通道,我们可以同时检测7个样品,剩下一个通道作为质控。
abi s solid
ABI\'s SOLiD
  • SOLiDTM 3 系统是由AB公司研发的新一代超高通量基因测序分析系统。该系统采用结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板,以四色荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应为基础,对扩增的DNA片段进行大规模高通量测序。
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技术特点:
  • •高通量,SOLiD™ 3.0每个测序反应能够获得20G、400M 标签的数据量;
  • •高准确性,每个DNA碱基检测2次,增加了序列读取的准确性;
  • •高稳定性,测序时采用连接反应,有效地解决了多聚核苷酸序列难读取的问题;
  • •系统中两个独立控制的流动池和条码标定技术运用可以在单个测序中做很多不同的样品。
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IVET:

In Vivo Expression Technology

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IVET技术特点
  • 单交换重组,突变株基因功能不影响。
  • 往往无法筛选出哪些在体内启动较弱的或短暂启动的启动子。
  • 一些毒力基因在体内外都表达,IVET技术对这些基因无法筛选出来。
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STM:

Signature Tagged Mutagenesis

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Microbial genes are mutated by the insertion of a transposon or other insertional mutagenic method carrying a uniquely tagged DNA sequence

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STM的特点
  • 通过突变对毒力基因进行负筛选(negative screening method)
  • 感染宿主时是突变的混合体 a mixed population
  • 可能会漏掉一些生长相关基因.
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DFI:

Differential fluorescence induction

gambit

GAMBIT:

Genomic Analysis and Mapping by In Vitro Transposition

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概念和特征
  • 分类
  • 功能
  • PAI与细菌致病性
  • PAI与细菌进化
  • PAI研究的方法和意义
  • 几种重要细菌的PAI
concept hacker
Concept(Hacker)
  • Uropathogenic E. coli. (UPEC)
  • 一个分子量很大的(>30kb)、载有多个毒力基因的不稳定的染色体DNA片段,外缘与tRNA基因和/或IS相连,存在于强毒株,在相关菌的弱毒株或无毒株中不存在或仅散在分布。
characterization 1
Characterization-1
  • 存在于细菌染色体上的DNA段( 20一100Kb ),载有编码许多毒力相关基因,产物多为分泌性蛋白、细胞表面蛋白和细菌的分泌系统、信息传导系统以及调节系统。
  • 位于细菌染色体上的特定位置,如tRNA位点内或附近,以及位于质粒、噬菌体整合有关的位置。
characterization 2
Characterization-2
  • 大多数两端具有顺向重复序列(RS)和插入序列(IS)。
  • 具有不稳定性,含有可移动成分,如IS 序列、整合酶(intergrase)、转位酶(transposase)以及质粒复制起始位点等,可在细菌之间进行水平位置的转移。
characterization 3
Characterization-3
  • DNA片段的G+C mol %、密码使用与宿主菌染色体具有明显的差异。
  • 一种病原菌往往具有一个或几个毒力岛,某些毒力岛可在不同的细菌中存在。
classification
Classification
  • 根据其G十C百分比与宿主菌的差异
  • 高G十C PAI,如小肠结肠炎耶尔森菌的PAI
  • 低G十C PAI ,如大肠杆菌、沙门菌以及幽门螺杆菌中的PAI
  • 根据其编码的产物性质
  • 致病性岛
  • 共生岛(symbiosis island),存在于根瘤菌中,与其共生特性有关
function 1
Function-1
  • 虽然都是编码毒力相关基因的DNA大片段,但其产物却因不同的细菌而有差异。
  • 具有编码III型分泌系统的基因,对致病菌侵袭宿主上皮细胞以及在巨噬细胞内的存活具有重要意义。
function 2
Function-2
  • 编码一些表面蛋白(如菌毛、环境感受器等)和外毒素(如hemolysin、TSST-1等)。
  • 含有调控成分,使其在赋予宿主细菌一些新的毒力特征的同时,还调控着其他毒力因子的功能。
  • 同一病原菌上的两个毒力岛之间也存在着基因的互相调控。
slide100
PAI与细菌致病性
  • PAI与新出现的病原菌有关,
  • 新发现的病原性微生物和重新抬头的病原性微生物是目前世界卫生界应予重视的一个重大问题
  • 近几年新出现的病原性细菌有嗜肺军团菌、伯氏疏螺旋体、0139霍乱弧菌、0157:H7大肠杆菌等与获得PAI相关
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PAI与细菌进化
  • PAI的形成
  • PAI的边缘序列
  • PAI与细菌对环境的适应性
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PAI的形成

也是一种基因进化过程

  • Gene evolution: 点突变,基因重排,缺失,插入
  • 水平转移机制:质粒,噬菌体,转座子,IS,基因岛重组
  • 细菌先获得一组基因,根据环境适应性选择基因,分别进化为生态岛,腐生岛,共栖岛或PAI
  • 猜测是由质粒或phage整合到染色体形成(失去复制基因)
slide104
PAI的边缘序列
  • 同向重复序列(RS)作用:特异性重组的靶位点,并促进重排
  • 插入元件(IS)作用:与PAI的切除和整合有关
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PAI的边缘序列

tRNA基因

  • 许多PAI位于tRNA基因附近,tRNA基因是外源DNA和噬菌体整合到细菌染色体的靶位
  • PAI与tRNA基因关系密切,tRNA位点在致病菌进化中起关键作用
  • 从tRNA基因位点寻找新的PAI
slide106
PAI与细菌对环境的适应性

致病菌获得PAI,失去低选择值基因片段,使细菌更加适应外界环境

  • 某些PAI缺失频率为10-5~10-4
  • 链霉菌可缺失800kb的DNA,基因缺失变异株比野生株适应环境能力更强
slide107
PAI研究的方法和意义

研究方法

  • 正向方法:从结构到功能
  • 反向方法:从功能到结构
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PAI研究的方法和意义

常用的分子生物学技术

  • 消减法杂交(subtractive hybridization)
  • G+C content, codon usage
  • 整合位点分析.Islande (tRNA screening)
  • 比较基因组 (comparative genome)
  • 毒力岛探查法(island probing)
slide109
PAI研究的意义
  • 新出现的病原菌产生的分子机制和进化
  • 病原菌的致病机制
  • 病原菌与宿主细胞的作用
  • 细菌疫苗
salmonella pathogenicity island spi
Salmonellapathogenicity island (SPI)
  • 目前已在沙门菌中发现5个PAI:SPI1-SPI5。 SPI G+C mol为37~47%(染色体为52%)
  • 其中SPI1编码与侵袭力有关的III型分泌系统(type III secretion system,TTSS );SPI2编码与系统感染有关的TTSS
salmonella pathogenicity island spi1
Salmonellapathogenicity island (SPI)
  • SPI1位置:染色体63 ’-62.5 ’ 位点之间,全长约40 kb,G+C含量为42%,它至少含29个编码TTSS各组分的基因,包括调节子和效应子。
  • SPI1功能: SPI1编码的TTSS使沙门菌能够侵入非吞噬细胞,与腹泻的发生有关。
salmonella pathogenicity island spi3
Salmonellapathogenicity island (SPI)
  • SPI2位置:染色体31 ’-30.5 ’ 位点之间,全长约40kb,主要基因有ssa、ssr、ssc和sse。ssa编码III型分泌系统成分,ssr编码分泌系统调节子,ssc编码chaperone,sse编码分泌系统效应蛋白。
  • SPI2功能:SPI2编码的TTSS为细胞内致病所必须,同时对沙门菌在细胞内的存活起重要作用。
salmonella pathogenicity island spi5
Salmonellapathogenicity island (SPI)
  • SPI3长17kb,位于染色体82 ’ 处,其编码产物可介导细菌在巨噬细胞和低Mg2环境中存活。
  • SPI4长25kb,位于染色体92 ’ 处,编码介导毒素分泌的I型分泌系统,并参与调节细菌适应巨噬细胞内环境,但其主要功能有待进一步研究。
  • SPI5长7kb,位于都柏林沙门菌染色体25 ’处,编码参与肠粘膜液体分泌和炎症反应的相关蛋白。
h pylori cag pai
H.Pylori cag PAI
  • 称为细胞毒素相关抗原毒力岛(Cag PAI),长40kb,不稳定,其产物与胃炎和胃癌的发生有密切关系。
  • cag PAI功能:编码类似于其他细菌的IV型分泌系统,与毒力因子的输出有关。
h pylori cag pai1
H.Pylori cag PAI
  • G十C含量35%,明显高于H.Pylori基因组的其他区域(39%),
  • cag PAI可分下游的cagI区和上游的cag II区,一些菌株的cag毒力岛两个区被插入序列IS605所分隔
h pylori cag pai2
H.Pylori cag PAI

H.Pylori cag PAI示意图

yersinia high pathogenicity island hpi
Yersinia high pathogenicity island(HPI)

基本特征:

  • 载有耶尔森菌素与毒力相关性的编码基因
  • 仅存在于强毒株,如小肠结肠炎耶氏菌(Yen)中仅有1B生物型才具有完整的Yen HPI
  • G十C mol%与耶尔森茵染色体有明显差异(一般高于)
  • 大的染色体片段(大于35kb)
  • 为一紧密、明确的遗传学单位,两端通常为同向RS DR17
  • 外缘与tRNA基因相连
yersinia high pathogenicity island hpi3
Yersinia high pathogenicity island(HPI)
  • 功能:
  • HPI 携带与铁摄取有关的基因簇,组成耶尔森杆菌素介导铁摄取系统,缺铁条件下Yen HPI 合成铁载体Ybt,从宿主转铁蛋白分子上夺取铁供细菌生长使用。
  • Ype HPI和Yps HPI有储存血红素功能,还具有增强虫媒跳蚤传播鼠疫杆菌的能力。
stap aureus spi
Stap.aureus SPI
  • 金黄色葡萄球菌毒力岛(SaPI)长15.2kb,含有tst基因,编码产生中毒性休克综合症毒素(TSST),其临界部分有17bp同向重复序列,插入tyr B和trp位点,可通过噬菌体转移。
stap aureus spi1
Stap.aureus SPI

金黄色葡萄球菌毒力岛示意图

locus of enterocyte effacement lee pai
locus of enterocyte effacement(LEE)PAI
  • attaching and effacing lesion (AE损伤):EPEC和EHEC在致病过程中的特征性组织病理学变化
  • 机制:LEE毒力岛
iocus of enterocyte effacement lee pai
Iocus of enterocyte effacement(LEE)PAI
  • LEE毒力岛结构特点:位于染色体82’位点,插入在selC-tRNA处,G+C mol%为39,染色体为51%,两侧无RS和IS
  • LEE毒力岛功能:编码III型分泌系统,介导AE损伤
v cholerae pathogenicity island vpi
V.Cholerae pathogenicity island(VPI)
  • 结构特点:大小为39.5kb,含整合酶和转座酶基因,两侧分别为20bp的att附着位点,VPI含有基因为aldA,tagA~D cluster,TCP cluster 和ACF cluster,G+C mol为35%,细菌染色体为47-49%
v cholerae pathogenicity island vpi1
V.Cholerae pathogenicity island(VPI)
  • 主要编码产物:

毒素协同调节菌毛(toxin coregulated pilus,Tcp)

辅助定居因子(accessory colonization factor,Acf)

  • 功能:与细菌定植、转录激活和整合等有关
  • VPI毒力岛与细菌进化:形成新的霍乱产毒株
references
References
  • 1. Clinical microbiology reviews, 2004, p. 14-56
  • 2. Current opinion in cell biology, 2000,12: 420-430
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  • 4. MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Dec. 2004, p. 692–744
  • 5. Progress in Biophysics & Molecular Biology 83 (2003) 1–45
  • FEMS Microbiology Reviews 24 (2000) 21-44
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