Material & Methoden Patientenkollektiv

1. Ergebnisse I • Metastasierungsrisiko • 156Gene(204 Sondensets) zwischen metastasierten und nicht metastasierten NZKdifferenziell exprimiert (Abb. 1), 25 und 131 in metastasierten NZK • klinisch ist auch Unterscheidung “spät vs. nicht metastasierte NZK” wichtig  39 differenziell exprimierte Gene (43 Sondensets), 6 und 33 in spät metastasierten NZK • 5-Gen-Vorhersagemodell auf Basis dieser 195 Gene (Tab. 2) zur Unterscheidung (spät) metastasierter und nicht metastasierter NZK metastasierte, nicht metastasierteNZK • Ergebnisse II • Tumorzell-dormancy und DFS • 353 Gene (457 Sondensets) differenziell exprimiertin “früh vs. spät vs. nicht metastasierten NZK” (Abb. 2) • 111 Gene verändert exprimiert zwischen früh und spät metastasiertenNZK, 72 und 39 in früh metastasierten NZK • Vergleich dieser 111 Gene mit (Abb. 3) A) 316 zw. frühen und späten pulmonalen Metastasen differenziell exprimierten Genen [1]  28 Gene in primären NZKund pulmonalen Metastasen dereguliert  tumorintrinsische Expressionsmuster, die potenziell funktionell an dormancy beteiligt und prognostisch nutzbar B) Ergebnissen anderer Microarray-Studien zur Prognoseabschätzung von NZK [3-5]  9 der 28 Geneauch in anderen Studien identifiziert (Tab. 3) Abb. 1: Metastasierte vs. nicht metastasierte NZK Das hierarchische Clustern (complete linkage, Pearson uncentered) veranschaulicht die Trennung von metastasierten und nicht metastasierten NZK anhand der Expressionsdaten der 156 differenziell exprimierten Gene. andere Microarray-Studien an NZK (95 Gene) [3-5] * frühe vs. späte pulmonale Metastasen (316 Gene) [1] 12 früh,spät, nicht metastasierte NZK 9 Abb. 3: DFS — Vergleich primärer NZK und Metastasen 28 (annotierte) Gene sind sowohl in “frühen vs. späten Metastasen” [1] als auch in “früh vs. spät metastasierten primären NZK” differenziell exprimiert. 9 dieser 28 Gene wurden zudem in anderen Microarray-Studien zu NZK als DFS-assoziiert identifiziert. * Vergleich primärer NZK von Patienten, die innerhalb eines definierten Zeiraums nach Nephrektomie (4 bzw. 5 Jahre) verstarben oder Metastasen entwickelten und Patienten, für die dies nicht zutraf 4 19 Abb. 2: Früh vs. spät vs. nicht metastasierte NZK Das hierarchische Clustern (complete linkage, Pearson uncentered) veranschaulicht die nahezu vollständige Trennung der drei Gruppen anhand der Expressionsdaten der 353 differenziell exprimierten Gene. Früh und nicht metastasierte NZK unterscheiden sich eindeutig; spät metastasierte liegen dazwischen. früh vs. spät metastasierte primäre NZK (111 Gene) Zusammenfassung & Ausblick • Genexpressionsunterschiede zw. metastasierenden und nicht metastasierenden NZK können als Vorhersageparameter herangezogen werden • Faktoren, die zwischen früh und spät entwickelten pulmonalen Metastasen differenziell exprimiert sind, sind zum Teil schon im Primärtumor dereguliert  dormancy- / DFS-assoziierte tumorintrinsische Expressionsmuster Ausblick • Validierung der identifizierten Faktoren am selben und einem unabhängigen Patientenkollektiv (quantitative PCR, Immunhistochemie) • Vorhersagemodelle zu Metastasierungsrisiko und DFS (Einbeziehung klinischer Parameter) Rückschlüsse auf Phänotyp anhand der Genexpressionsmuster Vorhersagemodelle Genkombination, die NZK korrekt jeweiliger Gruppe zuordnet (Leave-1-Out-Kreuzvalidierung; weighted voting, k-nearest neighbouring) Auswahl des Patientenkollektivs (klarzelliges NZK; früh, spät bzw. nicht metastasiert; Tab. 1) Literaturrecherche Bioinformatische Auswertung RNA-Isolation aus kryokonservierten Gewebeproben (Gewebeschnitte; RNeasy Mini Kit, Qiagen; RNA-Integritätszahl  6,9; Tumorzellgehalt 70 %) Probenbearbeitung Identifizierung differenziell exprimierter Gene t-Test (“met. vs. nicht met. NZK”) oder ANOVA + Tukey-HSD (“früh vs. spät vs. nicht met. NZK”); FDR < 5% intensitätsabhängiger Fold-Change ≥ 1,7 bzw. 1,8 {(mediane Signalint. aller Arrays * log ratio) / mittlere Signalint. des Gens} Microarray-Analysen (One-Cycle Target Labeling and Control Reagents Kit, HG‑U133 Plus 2.0-Arrays, Affymetrix) Präprozessierung der Rohdaten Hintergrundkorrektur, Normalisierung, Signalberechnung, log2-Transformation (RMAExpress 5.0), Batchkorrektur (Combat [2]), Herausfiltern gering exprimierter und nicht regulierter Gene Vorhersage von Metastasierungsrisiko und krankheitsfreiem Überleben von Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom (NZK) durch Genexpressionsanalysen P03 D. Wuttig 1, S. Füssel1, M. Meinhardt 2, M. Toma 2, S. Zastrow 1, B. Baier 3, A. Herr 4, C. Höfling 1, M. Großer 2, K. Junker 5, M.-O. Grimm 1, A. Meye 1, A. Rolle 3, M.P. Wirth 1 1 Klinik für Urologie, 2 Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Dresden; 3 Fachkrankenhaus Coswig, Abteilung Thorax- und Gefäßchirurgie; 4 Institut für Klinische Genetik, Universitätsklinikum Dresden; 5 Klinik für Urologie, Universitätsklinikum Jena Tab. 2: 5-Genmodell zur Vorhersage einer Metastasierung beim klarzelligen NZK Einleitung & Zielstellung • Metastasierung und krankheitsfreies Überleben (DFS) sind bedeutsame überlebens-assoziierte Parameter beim NZK • DFS spiegelt Dauer des Ruhezustands der Tumorzellen im Sekundärorgen (dormancy) wider • molekulare Grundlagen von Metastasierung und dormancy unzureichend verstanden  molekulare Prognosemarker fehlen • bisherige Ergebnisse [1]: Expression von 316 Genen zw. frühen (DFS ≤ 9 Monate) und späten (DFS ≥ 60 Monate) pulmonalen Metastasen verändert [1]  Ziel der Studie transkriptomweiter Vergleich primärer NZKzur Identifizierung von • metastasierungsassoziierten Faktoren • in Metastasen und Primärtumoren deregulierte DFS-assoziierte Faktoren • = potenziell funktionell an dormancy / DFS beteiligt • = potenzielle prognostische Marker Material & Methoden Patientenkollektiv Tab. 1: Klinisch-pathologische Daten der untersuchten Patienten Tab. 3: 9 überlappende Gene, die in pulmonalen Metastasen, primären NZK und anderen Studien als DFS-assoziiert identifiziert wurden (Nephrektomien in den Urologischen Kliniken der UKD Dresden und Jena; TNM-Klassifikation nach UICC-Kriterien, Grading nach Thoenes) Arbeitsablauf Referenzen [1] Wuttig et al., Int. J. Cancer, 2009, Epub [2] Johnson & Li, Biostatistics 2007, 8, 118 [3] Kosari et al., Clin Cancer Res 2005, 11, 5128 [4] Takahashi et al., PNAS 2001,98, 9754 [5] Sueltmann et al., Clin Cancer Res 2005, 11, 646 [6] Yao et al., Int J Cancer 2008, 123, 1126 Danksagung Diese Studie wurde durch die Dr.-Robert-Pfleger- und die Jürgen-Manchot-Siftung finanziell unterstützt. . * Alle Gene zeigen in den Metastasen einen höheren Fold-Change als in den Primärtumoren. Das deutet darauf hin, dass sich diese Signatur während des Metastasierungsprozesses durchgesetzt hat; §Ensembl genome browser (ENSG00000169116)