Компоненты ИФА

1. Компоненты ИФА • Аналит – определяемое вещество • Лиганд – вещество избирательно связывающееся с аналитом • Метка – легкоопределяемое соединение, добавляемое в анлитическую систему для измерения количества аналита

2. Авидность – прочность комплекса АГ-Ат • Афинность – сродство активного центра Ig с АГД

3. Иммуноферментный анализ • Гомогенный - все 3 стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся ИК от непрорегировавших компонентов. Для определения низкомолекулярных субстанций.

4. Иммуноферментный анализ • Гетерогенный– анализ проводится в двухфазной системе с участием твердой фазы (носителя) и обязательной стадией разделения ИК от непрореагировавших компонентов (отмывка). • Гетерогенные методы, в которых формирование ИК на 1 стадии протекает на твердой фазе ,называют твердофазными.

5. Гетерогенный твердофазный ИФА По типу реагентов присутствующих первой стадии: 1.Конкурентный На первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. 2. Неконкурентный– характерно присутствие в системе на 1 стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

6. Этапы ИФА • Взаимодействие аналита с лигандом • Формирование меченного комплекса • Измерение сигнала

7. Конкурентный ИФА для определения антигенов Искомый антиген(1) и меченыйферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

8. . Определение АТ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АГ(прямойИФА)

9. Определение АГ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АТ)прямой ИФА

10. Твердая фаза Полистирол,поливинилхлорид,полипропилен устойчивость к растворам, используемым в реакциях наличие высокой специфической емкости, т.е. способности сорбировать на своей поверхности АГ или АТ в количествах, необходимых для проведения реакции низкая неспецифическая сорбция белков из исследуемых образцов и конъюгатов Пути решения этой проблемы: добавить белок, заполняющий свободные центры связывания на поверхности пластика «забивка» развести сыворотку в 10-100 раз Иногда забивку совмещают с разведением

11. Конъюгат • Конъюгат – продукт химической сшивки АТ ( АГ) с ферментным маркером (вторые АТ). Используют АТ к Ig того класса, который мы желаем выявить.

12. Конъюгат должен обладать следующими свойствами • Высоким антительным титром и высокой афинностью к АГ. • Достаточной специфичностью в рабочем разведении • Преобладанием мономерных форм над полимерными • Оптимальным молярным соотношением между ферментом и АТ (1:1) • Достаточной ферментативной активностью

13. Субстрат • Бесцветное вещество –хромоген • Ортофенилендиамин • Тетрамитилбензидин

14. Основные требования к субстрату • Обеспечение высокой чувствительности • Образование хорошо учитываемых продуктов реакции фермент-субстрат • Должен быть безопасным, дешевым, доступным,удобным в применении. • Чаще используют хромогенные субстраты, которые разрушаясь образуют окрашенное вещество

15. Ферменты и субстраты, наиболее широко используемые в ИФА

16. Этапы проведения ИФА Положительный результат Отрицательный результат

17. Добавление аналита

18. Положительный результат Отрицательный результат Добавление конъюгата

19. Схема взаимодействия активного центра АТ и антигенной детерминанты

20. Определение АТ • Сероконверсия • первая сыворотка отрицательная • Вторая -положительная

21. Метод «парных сывороток» • Сравнение двух последовательных анализов, причем повторный анализ рекомендуется делать через 10-14 дней

22. Иммуноглобулин G • Строение

23. Иммуноглобулины • IgMопределение АТ этого класса необходимо для диагностики острого периода заболевания • IgG появляются в период реконвалесценции и у переболевших сохраняются 10 лет и более.Используется для оценки напряженности поствакцинального иммунитета и определение инфекции в анамнезе.

24. IgE специфический АГ на бумажном диске Определение специфическихIgE

25. HPR развитие цветной реакции Определение специфических IgE

26. СА-242 («сэндвич» вариант ИФА)

27. Твердая фаза Коньюгат Сыворотка/плазма ВИЧАГ Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ Твердая фаза –МАТ против р24 ВИЧ 1 Конъюгаты -1. Биотил.анти-р24 2.Авидин-пероксидазный

28. Твердая фаза Коньюгат Сыворотка/плазма IgG, IgA, IgM Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ Твердая фаза-gp160,gp36, композ.пептид Конъюгат – gp41,gp36 и пероксидаз. конъюгаты

29. 1 3 6 4 2 5 Тест полоски - Иммунодот Комбинация АГ на полосках

30. Высокой чувствительностью, позволяющей определять концентрации до 0,05 нг/мл Минимальные объемы исследуемого материала Стабильностью при хранении всех ингредиентов Простотой проведения реакции Наличием как инструментального, так и визуального учета Возможностью автоматизации всех этапов реакции Относительно низкой стоимостью диагностических наборов Преимущества ИФА

31. Полезные советы Выбор фирмы поставщика Цена не должна быть приоритетом Желательно комплектация 1-3 уровнями контр.кач. Совместимость с международ. контр.материалами Стабильность реагентов после открытия набора Срок годности тест-системы

32. Неправильная форма калибровочной кривой • Не правильно приготовлен раствор стандарта • Стандарт не был разбавлен разбавителем стандарта или рабочим буфером • Неправильная промывка • Ошибка при внесении стандарта или последующих шагах • Использование реагентов из других наборов или наборов другого лота

33. Полезные советы • Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не > 2%) • Не хранить реагенты в саморазмораживающимся холодильнике • Не используйте инкубаторы с конвективным нагревом • Оптимальное промывание • Регулярно проверять точность работы обрудования • Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в дублях • (разброс для 1 образца не > 5%)

34. Проблемы ИФА • Повышенный фон • Недостаточная промывка • Контаминация субстрата ионами металлов или окисляющими реагентами • Загрязнение дозатора или субстрата конъюгатом стрептовидина с ПХ • Неправильное разведение конъюгата Стреп.сПХ • Хромоген. субстрат находился на свету • Неправиьное время/ или Т0 инкубации • Испарение содержимого во время инкубации • Неправильное количество ФК или ХС

35. Не правильно разбавлены стандарты, конъюгаты Микропланшет накрыт пленкой во время инкубации с субстратом Превышение времени инкубации Нарушение Т0 режима Контаминация наконечника, субстрата Ф.К. Субстрат находился на свету перед использованием Повышенные оптические плотности образцов/стандартов

36. Отсутствие или слабое развитие окраски • Реагенты не достигли комнатной Т0 (25±20) • Не правильное хранение набора • Инкубация с Ф.К. при 370 вместо комнатной Т0 • Пропущена одна из инкубаций • Высыхание ячеек в ходе проведения анализа • Использование неподходящего субстрата или стоп-реагент. • Низкая Т0 в помещении <220 • Истечение срока годности реагентов • Не соответствующая длина волны считывания • Не правильное разбавление Ф.К.

37. Советы • Спектрофотометр перед измерением прогреть • 1 включение = 40 минут работы лампы • Увеличение сигнала при использовании марли обработанной хлорамином • Дистиллированная вода комн.Т. Не хранить воду более 2-3 дней. • Планшет для предварит. Разведения использовать однократно.

38. Советы • Не сокращать время инкубации с ОФД • Не допускать подсыхания лунок • При промывке лунки заполняются до самого верха • Особенно тщательно промывать после инкубации с конъюгатом • При отказе спектрофотометра – добавить стоп-реагент и быстро заморозить

40. Сомнительный результат • Ошибка дозирования 5% • Ошибка измерения спектрофотометра 10% • Серая зона Сыворотки, оптическая плотность которых отличается не более 15% от ОПкрит следует признать сомнительными

41. Сut off • Пороговое значение, превышение которого является положительным результатом

42. Отдельная посуда и наконеники Обработка 50% спиртом Промыть дистиллированной водой Измерять оптическую плотность не позже 30 мин ОФД, ТМБ

43. Автоматические пипетки • Погрешность пипеток не должна превышать 5% • 1мкл Н20 =1мг • Дозирование объема менее 10 мкл

44. Сбор, подготовка и транспортировка образцов для исследования на наличие антител к вирусу краснухи класса IgM и IgG • Материал для исследования - сыворотка крови. • Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальной контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторный забор крови. • Приготовление сыворотки. • Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной температуре (15-20град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой по внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стенок пробирки.Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках. • После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и помещают в холодильник при +2-+8 град. При необходимости более длительного хранения ее необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать сыворотку только 1 раз. • Условия транспортировки. • Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в лабораторию. Сыворотка крови стабильна при +2-+8 град в течении 12 часов. • Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты. • Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование - 200 мкл. • Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды. • Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток)

45. Спектрофотометры Спектрофотометры • Спектрофотометры • Обычно требуют длительного времени прогрева (указано в инструкции). Поэтому если ожидается измерение оптической плотностичерез 30 мин после очередного измерения, прибор лучше оставить включенным ( 1 включение равносильно 40 мин работы лампы). • Спектрофотометры имеют допустимую погрешность измерения до 10%.Проверить это можно, промеряя дважды один и тотже планшет и вычисляя различие в величине оптической плотности в одинаковых лунках. При этом планшет разворачивают так, чтобы лунка А1 заняла место Н12. • При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектрофотометра может возрастать.

46. Марля или фильтровальная бумага • При многократном использовании марли, обработанной хлорамином, возможно повышение сигнала (при попадании хлорамина в лунки)

47. Дистиллированная вода • Не хранить более 2-3 дней. Не добавлять азид натрия в качестве консерванта.. Он является ингибитором пероксидазы. Если вода хранилась в холодильнике, необходимо прогреть до комнатной t°.

48. Планшет для предварительного разведения сывороток • Использовать однократно.

49. Инструкции по применению • При получении новой серии наборов даже хорошо знакомой тест-системы – необходимо прочитать инструкцию. • Сознательные нарушения инструкции – сокращение времени инкубации с р-ром субстрата.Такие изменения протокола ИФАмогут существенно снизить выявляемость слабоположительных образцов, т.е. привести к ложноотрицательным результатам. • Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной Т° для предотвращения конденсации влаги на планшете если планшет разборный и используются не все стрипы сразу,то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, край покета завернуть и зажать скрепками.Не следует удалить покетик с влагопоглотителем. • Для предотвращения загрязнения не следует трогать верхнюю часть стрипов пальцами. • Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны. • В случае необходимостидлительного перерыва следует положить планшет вверх донышками на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу. • Реакция связывания АТ с АГ начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней сыворотки в планшет. • Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением. • Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата.

50. Отказ спектрофотометра • Быстро заморозить планшет после добавления серной кислоты с последующим быстрым оттаиванием перед измерением оптической плотности.Следует учмтывать, что о.п. все-таки возрастает, а относительный прирост сигнала более высок для небольших значений о.п.