Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 14

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty PowerPoint PPT Presentation


  • 88 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty. Bobovčák M., Klinické laboratórium VVÚCHP, Nová Polianka, Vysoké Tatry , Slovensko. BDT / BAT – funkčný test - FC – (Saint-Laudy 1994) - Alergie - Typ I hypersenzitivita (IgE)

Download Presentation

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty

Bobovčák M., Klinické laboratórium VVÚCHP, Nová Polianka,

Vysoké Tatry , Slovensko


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

BDT / BAT – funkčný test - FC – (Saint-Laudy 1994)

- Alergie - Typ I hypersenzitivita (IgE)

- Pseudoalergie - nonIgE, komplement, IgG, TypII,III , auto anti- IgE

- Nezachytáva Typ IV – bunkami sprostredkovaná hypersenzitivita

Princíp

Periférne Leu (WB) + stimulans v aktivačnom pufri + Inkubácia

detekcia expresie CD63(gp53) na FC identifikovaných bazofiloch

Basotest

Orpegen

FlowCast

Bühlmann

BD FastImmune

BD

100 ul WB

heparín

Izolované Leu 50 ul

ACD, EDTA

100 ul WB

heparín

Vzorka

BSB/Stimul

20/100 ul

0/50 ul

0/20ul

40 min

10 pred/20 min

10 –15 min

Inkubácia

N-FMLP

FcεRI

N-FMLP

Pozitívna K

EDTA?+Chlad/ Lýza

Ľad / Lýza

Ľad or EDTA/ Lýza

Stop/Lýza

CD63-FITC/ IgE-PE

CD63/ CD123/DR

Farbenie

IgE-Fitc/CD63-PE


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Cieľ: metodický postup pre optimálny BDT

pre vyšetrenie alergie a pseudoalergií (liečivá)

BDT – predanalytická fáza

Pacient:

vysadenie liekov – 14 dní steroidy, 48 hod. anti-histaminika/leukotriény

Odber:

heparín, štandardizovaný (5-7ml vacutainer a pod.) do 4 (24?) hod.

(sklo, plast, laminárny box, sedimentácia plnej krvi na gradiente 1077 3ml/3ml 40-50 min, odpipetované: 800 ul plazmy)

Izolované Leu

centrifugačne

Mononukleáry

gradient

Plazma

heparín

Plná krv

++++

+++

++++

+

Jednoduchosť

Nešpecifická

Stimulácia+TR

+

++

++++

+

Interakcie

(Liečivá)

Ery,Tr

proteíny

Ery,Tr

Tr

Tr

proteíny

++++

++++

Farbenie + FC

++

+++


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

BDT – reakčné pomery - postup

Apyrogénne, sterilné, 2 ml skúmavky EPP /otestovať/ , laminárny box

50 ul - Stimulačný pufer BSB (NC),

- 1ug/ml a-IgE(De2), 2uM N- FMLP (PC),

- stimulans / alergén v BSB

BSB = 20mM HEPES, 5 KCL,133 NaCL, 7 CaCl2, 3.5 MgCl2, 1 mg/ml HSA pH 7,4 (proTK )

10 ul r IL3 v BSB 10ng/ml zvyšuje senzitivitu (literatúra)

50 ul heparínovej plazmy / KO – analyzátor /

INKUBÁCIA 37oC, vodný kúpeľ

20 min silné alergény (inhalačné, potraviny... )

40 min slabé alergény (liečivá... ) (kontrolný pacient)

STOP: ľadový kúpeľ 5 min.

FARBENIE protilátkami: 25-30 min. na ľade

PREMYTIE pufrom WB = 0,1 % BSA v PBS 1,5 ml

RESUSPENDOVANIE 600ul WB –

AKVIZÍCIA - FC (300 – 500 - 1000 bazofilov)


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Negatívna kontrola BSB – do 10% CD63+Bazo n=30

spontánna stimulácia / vylúčenie nešpecifickej stimulácie /

n=15

% CD63+ Bazo


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

  • Pozitívna kontrola

  • Anti IgE(De2) 70%-90% CD63+Bazo ( 25% nonresponder)

  • N – FMLP peptid 30%-60% CD63+Bazo

  • Anti IgEeRI ? - výhodnejšie ako anti IgE (5% nonresp. Lit.)

NC - pufer

PC – a-IgE

CD63 Fitc

CD63 Fitc

SS

SS


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Stimulans / Alergény

Silné alergény : inhalačné, potraviny, latex, jedy /insekty/

  • veľmi dobrá korelácia s inými testami aj s BDT z plnej krvi u latexu vynikajúca.

  • Komerčne dostupné pre BDT :napr. Bühlmann Použiteľné Stallergen, Sevapharma ! PNU jednotky

  • Kritická : 1.čistota /!!!! aditíva ako azid, mertiolát, fenoly interakcia s bielkovinami, trombo, ery...

  • 2.koncentrácia v teste musí byť predtestovaná !!! S ohľadom:

  • - na senzitivitu – čo najvyššie percento CD63+bazofilov

  • - na špecifitu – pacient reaguje v závislosti od dávky,

  • nealergický pacient nereaguje pri danej konc. alergénu

Slabé alergény : liečivá a pod.= nízka odpoveď CD63+Bazo

  • Senzitivita lepšia pri použití izolovaných Leukocytov

  • komerčne dostupné pre BDT :napr. Bühlmann – literatúra ,

  • Kritické!!! : Čistota, Koncentrácia - v teste využiľ kontrolu na negatívneho pacienta, pracovať vždy dávkovo /najmenej 2 koncentrácie/ a NC v duplikáte.

  • Interakcie – inhibícia BDT, s bunkami a bielkovinami

  • Použitie originálnych farmák. Vodítko www. Bühlmann.com

  • Testované u nás:

  • ACP, Ibuprofen, Penicilín G, V,Amoxicillin ,Ciprofloxacin Arduan, Norcuron


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

1.IgE+ bunky, intenzita farbenia klesá po aktivácii

2.CD203c + bunky, intenzita farbenia stúpa po aktivácii

3.CD123+ bunky

BDT – identifikácia bazofilov

Aktivácia

1.CD203c+ bazofily,mechanizmus upregulácie nejasný

2. CD63+ bazofily, enzymatická kaskáda pri aktivácii a degranulácii

vedie k externalizácii intracelulárnych komplexov s transmembr. CD63

Protilátky

aCD203c-PE ( 97A6) bazofily,mastocyty, megakaryoc. CD34+bb. - Immunotech

aCD123 - PE (IL3Rα, 9F5) bazo, mono, Eo, dendritické bb. - BD

aHLA DR- PCP (1.243, Bazo- Low SS, Eo- High SS), (B, Mono, dendrit.bb.+) - BD

aCD63 – FITC (gp53, H5C6) akt. bazo, akt. Trombo, Monocyty,MF -PharMingen

aCD45 – PC7 Pan Leu Trombo- , Ery - -Immunotech


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

63 / 203c / 45 versus 63 / 123 / DR / 45

WB

CD203c PE

CD203c PE 45+

CD203c PE

WB

Plazma

SS

SS

SS

CD203c PE 45+

CD123 PE 45+

CD123 PE 45+ DR-

Plazma

Plazma

Plazma

SS

SS

SS


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Stratégia gatingu63-FITC/123-PE/HLADR-PCP/45-PC7

CD123 PE

CD45 PC7

DR-PCP

1

2

Bazo

Leu – Live Gate

DR-PCP

SS

SS

3

FW

CD63 Fitc

CD123 PE

Bazo

Aktivované

Bazo

SS

SS

SS

Live Gating CD45, Low SS, kompenzácia !!!


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Pozitivita vs Negativita

CD63 Fitc

CD63 Fitc

CD63 Fitc

TopCast

666 bazo

91,0%

PC – a-IgE

559 bazo

94,6%

NC

514 bazo

2,0%

SS

SS

SS

1

1

1

CD63 Fitc

CD63 Fitc

CD63 Fitc

PC – FMLP

497 bazo

35 %

PC – FMLP

754 bazo

7 %

PC – IgE

700 bazo

8 %

SS

SS

SS

3

3

2

Zodac, Flixonase, Seretide


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Liečivá , Interakcia trombocytov

CD63 Fitc

CD63 Fitc

CD63 Fitc

NC

609 bazo

15%

Ibuprofen

742 bazo

7%

ACP

973 bazo

18%

SS

SS

SS

1

1

1

Ibuprofen

345 bazo

14%

CD45 PC7

CD62P Fitc 45+

CD63 Fitc

1 %

0,4 %

5%

SS

SS

2

Trombocyty, interakcia s liekmi, koagregáty s Leu, aktivácia


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Reprodukovatelnosť IntraAssay CV

% CD63+ Bazo

Negatívne kontroly, triplikáty, n=10 - CV 15,9 %

Pozitívne kontroly n=5, duplikáty – CV 4,3 %

Hodnotenie– silné alergény% CD63+ Bazofilov

NC<10%, PC(IgE) 70-90%, PC(FMLP) 30-70%, Stimul > 20%

Hodnotenie– slabé alergény (liečivá)

Stimulačný index SI=%akt.Bazo Test / %akt.Bazo NC

Negatívne SI<1,3 Dubiózne SI= 1.3-2,0 Pozitívne SI>2,0

Negativita neznamená , že pacient nezareaguje klinicky !

!dávkový režim, duplikáty, optimalizovaná cc!

!


Bazofiln degranula n test na prietokovom cytometri metodick aspekty

Záver

Prezentovaný Bazofilný degranulačný / aktivačný test

vo vlastnej optimalizovanej modifikácii, v ktorom sme skombinovali aj niektoré výhody komerčne dostupných testov, je použiteľný pre testovanie hypersenzivity

na silnejšie alergény , slabšie alergény i liečivá,

za dodržania vyššie spomínaných odporúčaní.

Je pracovne nenáročný a lacnejší ako komerčné sety.


  • Login