תהליכי הפרדה למוצרים ביולוגיים

1. תהליכי הפרדה למוצרים ביולוגיים ניתוח ואופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים פרופ' גדעון פלמינגר המחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ולביוטכנולוגיה אוניברסיטת ת"א

2. The Chromatographic Process

3. פרמטרים המשמשים באנליזה ובאופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים ns - No. of moles of Protein x in the Stationary Phase nm - No. of moles of Protein x in the Mobile Phase to - Retention time for unretained compounds tR - Retention time for Protein x u - Linear velocity of the Solvent ux - Linear velocity of Protein x

4. שיקולים סטטיסטיים • עבור חלבון בעל a נתונה: • בכל רגע נתון היחס בין מספר המולים בפאזה הניידת לבין סה"כ המולים של החלבון שווה ל- a • הסיכוי של מולקולה מסוימת להיות בפאזה הניידת ברגע נתון שווה ל- a Stm= t0 ts S(tm+ts)= tR a= t0/tR t0 tm

5. פרמטרים המשמשים באנליזה ובאופטימיזציה של תהליכים כרומטוגרפיים +

6. The Correlation of the Capacity Factor (k’) and Affinity Constant (Ka)

7. Effect of Sample Load on k’

8. The Correlation of the Capacity Factor (k’) and Distribution Constant (KD)

9. Evaluation of Chromatographic Behavior Theoretical Plate tR and VRvary from one compound to the other. L is common to all compounds separated on a column

10. The Theoretical Plate

11. Diffusion

12. Effect of Linear Velocity on Peak Broadening Van Deemter Equation

13. Peak Broadening

14. Peak Broadening (Cont.)

15. Peak width

16. Peak Broadening (Cont.)

17. Velocity vs. Pressure

18. Spherical and irregular HPLC Packings

19. Peak Tailing

20. Evaluation of Peak Tailing

21. Causes for Peak Tailing • Overloading • Poor Column packing (Channeling) • Mixed Retention Mechanism • Poor Equilibration and/or Slow Mass Transfer • Extra-Column Effects • Micelle Formation

22. Resolution + *k1/k1 1

23. Two-Peak Separation

24. Separation Optimization

25. The Correlation between k’ and tw tw=4to/N K=tR/to-1

26. Effect of Solvent Strength

27. Effect of Selectivity (a)

28. Effect of Efficiency (N)

29. Effect of temperature on RP If DG<0 andT Then Ka and k’ Peaks usually become sharper at higher temperatures

30. HPLC ו- FPLC

31. Automatic Control The HPLC Chromatographic System Damp Back-Pressure Regulator

32. Problems Derived from High Pressure Chromatography • Need for Pressure Control/Monitoring. • Stainless Steel Columns. • High Pressure/Low Stroke Volume Pumps. • High Pressure Mixing. • High Pressure Injectors. • Need for Gas Bubbles Elimination – Degassing and/or Back Pressure Regulator.

33. The FPLC Computer Control Injector Pump A Mixer Fraction Collector Pump B Column Buffer A Buffer B UV Monitor Conductivity Meter

34. FPLC vs. HPLC HPLC • High Pressure Operation • Uses Mostly Reversed and Normal Phase Chromatographies Often with Organic Solvents – Applicable to small proteins, peptides and low MW molecules. • Highest advantage – High Resolution. FPLC • Medium Pressure Operation. • Uses Mostly Ion Exchange, Hydrophobic, Affinity and Gel Chromatographies in aquous buffers – Highly applicable to proteins. • Highest Advantage – Ease of Operation and Versatility.