Adn recombinante
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ADN recombinante. Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED. IMPORTANCIA BIOMÉDICA. Diagnóstico Medicina forense Terapia génica Producción de medicamentos insulina factores de la coagulación activador del plasminógeno hormona de crecimiento Producción de vacunas

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Presentation Transcript


Adn recombinante

ADN recombinante

Dr. Luis A. Mora B.

Cátedra de Bioquímica

UCIMED


Adn recombinante

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

  • Diagnóstico

  • Medicina forense

  • Terapia génica

  • Producción de medicamentos

    insulina

    factores de la coagulación

    activador del plasminógeno

    hormona de crecimiento

  • Producción de vacunas

    Antihepatitis B


Adn recombinante

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

  • Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN (base molecular de la enfermedad)

  • Hipercolesterolemia familiar

  • Drepanocitosis

  • Talasemias

  • Fibrosis Quística

  • Distrofia Muscular


Adn recombinante

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

  • Forma (doble hélice de nucleótidos)

  • Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces fosfodiéster)

  • Apareamiento de las bases (A:T, G:C)

  • Pares de bases en genoma haploide humano (3x109)

  • Longitud de genes (3x103)

  • Empacamiento del ADN(histonas)


Adn recombinante

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN


Adn recombinante

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

  • Replicación

  • Transcripción (Exones e intrones)

  • Traducción

  • Síntesis de proteínas


Adn recombinante

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN


Adn recombinante

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

  • Aislamiento del ADN

  • Desnaturalización

  • Manipulación

    Endonucleasas

    Polimerasas

  • Formación de moléculas quiméricas


Adn recombinante

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

endonucleasas

  • Endonucleasas:

    • enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ; estos tienen entre 4 y 12 pb.

    • Cortan ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos: romos y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas.

    • Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina humana.


Adn recombinante

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:

endonucleasas

  • Organismos procarióticos (bacterias)

    • Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio.

    • No pueden cortar ADN metilado.

  • Isoesquizómeros:

    • de diferentes especies

    • idéntica diana

    • dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.


  • Adn recombinante

    ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

    Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes:

    1. Cohesivos o pegajosos:

    GAATTC GGATCC AAGCTT

    CTTAAG CCTAGG AACGAA

    EcoRI BamHI HindIII

    2.  Abruptos:

    AATATT CCCGGG

    TTATAA GGGCCC

    SspI SmaI


    Adn recombinante

    TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE


    Adn recombinante

    ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

    endonucleasas

    • Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan).

    • cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo)

    • dejan extremos cohesivos

    • Necesitan ATP

    • Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores.

    • Tipo 2: Sólo restricción.

    • otras enzimas metilan.

    • cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy cerca de él.

    • son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas)

    • sólo requieren Mg+2 como cofactor.

    • no necesitan ATP.

    • Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades)

    • cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos.

    • requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la misma cadena de ADN.

    • Necesitan ATP, Mg y SAM.


    Adn recombinante

    ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

    Nomenclatura

    El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:

    1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo:

    Escherichiacoli (Eco)

    2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )

    3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.

    4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.


    Adn recombinante

    TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:

    vectores

    • Definición

    • Vectores

      Plásmidos

      bacterianos

      ADN circular de doble banda

      Inserción de 6-10 Kb

      Fagos

      virales

      ADN lineal de doble banda

      inserción de 10-20 Kb

      Cósmidos

      Son plásmidos con características de fagos

      ADN circular de doble banda

      inserción de 35-60 Kb

      YAC

      Son cromosomas artificiales de levaduras


    Adn recombinante

    TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

    Propiedades de los vectores

    • Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera

    • Secuencias de ADN conocidas

    • Copias únicas

    • Cromosoma más pequeño que el del hospedero


    Adn recombinante

    TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE


    Adn recombinante

    TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE


    Adn recombinante

    CLONACIÓN

    • Definición:

    • m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originado por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.

    • m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original.


    Adn recombinante

    CLONACIÓN


    Adn recombinante

    Gracias


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