Encadrée par : Sophie PAYOT-LACROIX Gérard GUEDON

1. Etude de la mobilité des éléments intégratifs conjugatifs (ICE) intégrés dans un gène codant un ARNt Lysine chez Streptococcus agalactiae Présenté par Aurore PUYMEGE LABORATOIRE DE GENETIQUE ET MICROBIOLOGIE UMR1128 INRA, Nancy-Université - IFR 110 Encadrée par : Sophie PAYOT-LACROIX Gérard GUEDON

2. Introduction Transfert horizontal ● Rôle clé dans l’évolution des génomes bactériens et dans l’adaptation aux changements environnementaux ● Transfert intercellulaire de l’ADN par : - transduction - transformation - conjugaison ● Transfert inter ou intra cellulaire de l’ADN par les éléments génétiques mobiles

3. Introduction Eléments intégratifs conjugatifs ou ICE Réceptrice Donatrice attI attI attB attL attR attL attR attB attR attR attL attL Pavlovic et coll., Microbiology, 2004

4. Introduction Streptococcus agalactiae • Bactérie appartenant au phylum des Firmicutes • Streptocoque de groupe B (GBS) • Aérobie-anaérobie facultatif • Environ 30% de la population est porteur asymptomatique • Bactérie pathogène chez : - les nouveaux-nés • - les personnes âgées - les personnes immunodéprimées • - les bovins mammites méningites pneumonies septicémies

5. Introduction ICE et éléments en dérivant chez Streptococcus agalactiae ● Etude sur les 8 génomes totalement ou partiellement séquencées ● Mise en évidence in silico de : - 12 ICE putatifs - 19 éléments en dérivant ● 15 sites d’intégration  Grande diversité de ces éléments chez S. agalactiae Brochet et coll., J. Bacteriol., 2008

6. Les éléments intégrés à l’extrémité 3’ de l’ARNtLys Introduction ● Grande diversité des éléments intégrés dans ce locus ● Présence de nombreux gènes pouvant être impliqués dans la réponse aux stress et la virulence de S. agalactiae

7. Objectifs Objectifs Etude de la fonctionnalité des 4 ICE putatifs intégrés à l’ARNtLys chez S. agalactiae - Est-ce que les quatre éléments sont capables de s’exciser ? - Est-ce que les éléments sont capables de se transférer ?

8. Résultats 100 pb ladder Test d’excision des ICE 2603 V/R COH1 18RS21 515 1 2 3 attR attL ARNt Lys ICE 1,5 kb 1 kb Excision 700 pb 597 pb 500 pb 492 pb 404 pb attB ARNt Lys 300 pb + 200 pb attI 100 pb 547 pb 400 pb Seul l’élément présent chez la souche 515 s’excise

9. attI attI’ attI’’’ attI’’ Résultats 100 pb ladder Test d’excision des ICE 18RS21 Excision COH1 2603 V/R 515 1 2 3 ICE 1,5 kb 1 kb 700 pb 3 2 597 pb 1 Excision 500 pb 492 pb 404 pb 300 pb 200 pb Excision attR’ ARNt Lys attL 100 pb attB ARNt Lys attL ARNt Lys attI attR 214 pb 315 pb + + + ARNt Lys attL’ attR 492 pb 404 pb 597 pb 547 pb ● Deux formes circulaires d’ICE_2603_tRNALys sont détectables

10. Résultats Test de transfert conjugatif ● Souche donatrice : ● Souche réceptrice : attB Nem316 RifR StrR attR attL 515 EryR COH1 RifR StrR ARNt Lys attI attI ARNt Lys A909 RifR StrR ●ICE_515_tRNALys se transfère à une fréquence maximale de 4x10-7 (+/-0,9 x10-8) transconjugants / cellule donatrice dans les conditions testées

11. Résultats Test de transfert conjugatif ● Blocage du contact entre cellules donatrices et réceptrices Donatrice et réceptrice Donatrice Réceptrice  Aucun transconjugant n’est observé Transconjugants  Pas de transconjugant Fréquence de transfert ● Ajout de DNase I dans le milieu  Les fréquences de transfert sont identiques avec et sans DNase I  Ces témoins excluent l’hypothèse d’un mécanisme de transformation

12. Discussion Conclusions DONATRICE RECEPTRICE Nem316 COH1 515 A909 2603V/R COH1 Nem316 18RS21

13. Discussion Discussion ● Pas d’excision d’ICE_COH1_tRNALys et ICE_18RS21_tRNALys (et donc de transfert) : - fréquence d’excision trop faible pour être détectée ou perte de la forme circulaire - régulation différente ● Pas de transfert d’ICE_2603_tRNALys : - fréquence de conjugaison trop faible pour être détectée - interruption d’un gène du module de conjugaison (orfD) ● Fréquence de conjugaison différente selon la souche réceptrice utilisée

14. Discussion Perspectives ● Vérification de la spécificité d’intégration d’ICE_515_tRNALys ● Caractérisation de la machinerie de conjugaison utilisée par ces éléments génétiques mobiles  Etude de la relaxase - rôle de la relaxase dans la régulation des gènes de l’élément - caractérisation du site reconnu par la relaxase, de sa spécificité et de ses partenaire(s) protéique(s) (relaxosome)