实验五

1. 实验五 • 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 • 玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段 • 质粒DNA的连接和转化

2. 第一部分 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 ——玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶 中DNA片段

3. 实验目的： • 掌握利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段的原理和操作技术; • 了解其他几种方法的原理与操作技术。

4. DNA片段分离回收常用方法： • 电洗脱法 • 低熔点琼脂糖凝胶法 • DEAE滤膜插片法 • 玻璃奶法

5. 电洗脱法 • 将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相。 • 回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。

6. 低熔点琼脂糖凝胶法 • 将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。 • 待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的EP管中，加300 µL TE。 • 65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。 • 酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。

7. DEAE滤膜插片法 • 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。 • 电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留。 • 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。 • 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。

8. 玻璃奶法

9. 实验原理： • 玻璃奶(Glassmilk)：无毒、无味、无腐蚀作用的白色硅颗粒，能专一性结合0.2kb至50kb大小的DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。 • DNA与玻璃奶结合原理：在高盐状态下，玻璃奶周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O/1×TE）时溶解分离。

10. DNA 结合率影响因素： • 盐浓度： • DNA<100bp:高盐状态下结合率高。 • DNA>100bp:低盐状态下结合率高。 • pH值： • pH<7.0:结合率高。

11. 应 用： • 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； • 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段； • 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； • DNA浓缩，去盐及去除杂质。

12. 本方法的优点： • 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等； • 简便：所需主要仪器是一架台式离心机； • 快速：整个回收过程只需半个小时； • 高效：回收效率达到70%以上； • 多用途：可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等； • 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。

13. 实验材料： • 使用Omega bio-Tek胶回收试剂盒（Ultra-Sep Gel Extraction Kit） Ultra-Sep Binding Buffer 300ml Ultra-Sep Beads 5.5ml DNA Wash Buffer 2×80ml Elution Buffer 60ml • 超纯水 • 无水乙醇

14. 方法和步骤： 琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段 切取所要的DNA条带 溶解琼脂糖/EB凝胶 结合玻璃奶 离心沉淀玻璃奶 洗脱DNA DNA产量和质量测定

15. 方法和步骤： 1．琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。 2．紫外灯下切取所要的DNA条带。 3．将切下胶块放入1.5ml EP管中，称重，以确定胶条的体积。 设定胶的密度为1g/ml，例如0.2g胶认为其体积为0.2ml。 4.加入等体积的Ultra-Sep Binding Buffer。 对长度低于400bp的DNA片段或大于2%琼脂糖凝胶，加入3×体积的Binding Buffer。

16. 5．涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads，加入10 µl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50～55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴过程中，每隔2 min震荡EP管悬浮Ultra-Sep Beads。注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的产量将会显著减少。如果混合物变为橙色或红色，则加入5 µl 5M NaAC（pH5.2）以降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该变为淡黄色。

17. 6．10,000×g室温离心1min，使Ultra-Sep Beads沉淀，弃上清。 7．加入300 µl Ultra-Sep Binding Buffer，涡旋震荡Ultra-Sep Beads以洗涤玻璃奶。10,000×g室温离心1min，弃上清。 8．加入750 µl预先按瓶上标签说明用无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer。涡旋震荡重悬玻璃奶，10,000×g离心1min，沉淀玻璃奶。

18. 9．弃上清并彻底去除离心管残余液体。空气中干燥5～10min。9．弃上清并彻底去除离心管残余液体。空气中干燥5～10min。 10．向管中加入15～50 µl（按最终产物浓度确定加入体积）Elution Buffer（10mM Tris，pH8.5）。涡旋震荡重悬沉淀，50℃水浴5min，10,000×g离心1min，沉淀玻璃奶。 如果用水洗脱DNA，确定水的pH值在7.5～8.0之间。 11．小心将上清转入另一EP管中，上清即含纯DNA。约80～90%结合DNA被洗脱下来。

19. 12. DNA产量和质量测定： 适当稀释DNA，测定A260及A280。按照计算公式计算DNA浓度： DNA浓度=吸光度260x50x稀释倍数mg/ml DNA纯度=A260/A280, ＞1.8表明样品核酸纯度＞90%。

20. 注意事项： • DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波紫外灯，切胶时间尽量短。 • DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从玻璃奶上脱落而导致回收率降低。 • 最后洗脱前尽量去除管壁和管底残留的洗涤液，否则可能导致结合的DNA无法洗脱或洗脱液含有杂质，影响继后操作。

21. 第二部分 质粒DNA的连接和转化

22. 实验目的 • 了解重组DNA分子连接及转化大肠杆菌的原理与基本操作方法。

24. 一、DNA分子的体外连接

25. 实验原理 • DNA分子的体外连接：在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸基团与3’端羟基，使二者之间形成磷酸二酯键的生物化学过程。DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

27. DNA连接酶 • 常用的DNA连接酶: 来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4 DNA连接酶 • DNA连接酶作用机理（T4 DNA连接酶为例）： T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-ATP复合物。 酶-ATP复合物结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。

28. T7 DNA ligase T4 DNA ligase

30. 注意事项 • 连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定。不同公司生产的DNA连接酶的最佳连接温度不同，对粘性末端与平末端的连接温度也不同。 • 连接效率：粘性末端效率高，平末端效率低，因而在底物浓度、酶浓度选择上存在差异。

31. 提高连接效率的方法： • 提高DNA的浓度，增加重组子比例。 • 缺点：会出现DNA自身连接问题，对于单酶切和平末端的DNA片段尤其如此。 • 解决方法：对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口在转化细胞后得以修复。

33. 提高连接效率的方法： • 将连接液放置4℃过夜可以增加连接效果。

34. 连接反应结果检测： • 转化宿主菌，阳性克隆筛选。 • DNA凝胶电泳。

35. 实验材料： • 纯化后的酶切质粒载体 • 目的基因片段 • DNA Ligation Mix（Takara） • T4 DNA 连接酶 • 缓冲液系统

36. 方法和步骤 • 反应体系： 线性化载体 pCDNA3（EcoR I 和Xba I 酶切） 3 µl（~0.1 µg） 3倍分子的目的基因p38片段 （EcoR I 和Xba I 酶切） 5 µl DNA Ligation Mix 8 µ 总体积 16 µl • 盖上管盖，混匀，台式离心机上离心５秒。 • 24℃连接1-3小时。 • 反应结束后于-20℃保存。

37. 二、重组DNA的转化及转化子的筛选

38. 实验原理: • 转化(Transformation)：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。 • 重组DNA转化：DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 • 感受态(Competence)：通过人工诱导的方法，使自然状态下无法发生转化的细菌，如大肠杆菌，处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态，从而使转化得以高效率地进行。 • 转化子(Transformant)：即转化后的受体菌,又叫重组子。重组子在培养环境中形成的克隆称为阳性克隆，外源DNA可在阳性克隆中大量扩增、繁殖、保存以及表达目的基因产物。

39. 质粒DNA转化大肠杆菌： • DNA分子转化步骤： 吸附：双链DNA分子吸附于受体菌表面； 转入：双链DNA分子解链，一条链进入受体菌，另一条降解； 自稳：外源质粒DNA分子的细胞内复制成双链； 表达：供体基因随同复制子同时复制、分裂、转录翻译。 • 转化效率：105~107转化子/µg DNA。获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。

40. 感受态细胞能接受外来DNA 分子的机制 • 局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： • 发芽的芽孢杆菌容易转化； • 大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； • 适量的溶菌酶能提高转化率。 • 酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是： • 蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用； • 细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现； • 分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

44. 转化子的筛选方法： • 插入失活法 • 抗性筛选 • 蓝白筛选(α互补法) • 杂交筛选 • 免疫学筛选 • 酶切图谱鉴定 • 菌落PCR鉴定

45. 常用方法： • 抗性筛选法： • 菌株为某种抗性缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素、卡拉霉素等），这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 • α互补法： • 许多载体（如pUC系列 ）含有一个大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lac z基因)的短区段，其中含有lac z的调控序列和头146个氨基酸编码区，这个编码区中插入一个多克隆位点。而受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。当没有外源基因插入时，二者融为一体后，有β-半乳糖苷酶表达，它能水解培养基中生色底物—5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal ）形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆位点，造成插入失活，从而使lac z基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同可以区分重组子和非重组子。

46. X-gal + IPTG + AMP with lacZ = blue colony

47. 实验材料 • LB培养基 • 质粒pCDNA3-p38连接产物（含Amp抗生基因） • CaCl2 0.1M • Amp • DH5α 大肠杆菌

48. 感受态细胞制备 1. 将宿主菌DH5 大肠杆菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20h。 2. 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃震荡过夜。 3. 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37℃震荡培养4～5h，测A600达0.4～0.5。 4. 培养物冰上放置10min。 5. 转入一50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10min。 6. 弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2，置冰上10min。 7. 5000rpm 4℃离心10min，弃上清。 8. 加入300 µl 0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，于4℃过夜。

49. 转 化 1. 在1.5ml Eppendorf管中加入100 µl感受态细胞和10µl pCDNA3-p38 DNA连接反应液，温和混匀，置冰上30分钟。 2. 42℃水浴45~60秒。 3. 立即冰浴2分钟。 4. 加入900 µl LB培养液，37℃孵育60分钟。 5. 10000rpm 离心15秒，吸去800上清。用剩余200 µl上清轻柔悬浮细胞。 6. 接种转化的细胞。 7. 37℃培养12~16小时，观察结果。

50. 注 意 事 项 1. 感受态细胞必须在冰上制备。 2. 所用液体和试管必须在冰上预冷。