Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test
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Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique. Soutenance de thèse : 5 Juin 2009. Anne-Laure RAFFIN. Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques. Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO. PLAN. Introduction

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Anne laure raffin

Phénotypage de la réparation de l’ADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique

Soutenance de thèse : 5 Juin 2009

Anne-Laure RAFFIN

Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques

Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO


Anne laure raffin

PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

L’ALTÉRATION DE LA MOLÉCULE D’ADN

Lésion de l’ADN

Source de dommages

Double hélice d’ADN

ADN lésé

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Apoptose

Introduction: la réparation de l’ADN

LES RÉPONSES CELLULAIRES FACE AUX DOMMAGES DE L’ADN

Source endogène ou exogène de dommage

cellule

Lésions de l’ADN

Arrêt réplication

Arrêt de la transcription

Réparation de l’ADN

Mutagénèse

  • Restauration de la séquence d’ADN

  • Reprise du cycle cellulaire

Cancérogenèse

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN

Site abasique

Adduits volumineux

Pontages intra et inter-brin

mésappariement

X

X

X

X

X

X

C

G

A

CH3

(CH3)n

U

X

X

T

T

Coupure double brins

Uracile

Modification de la base

Alkylation

Dimère de Pyrimidine

O6 methyl guanosine

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN

Site abasique

Adduits volumineux

Pontages intra et inter-brin

mésappariement

X

X

X

X

X

X

C

G

A

CH3

(CH3)n

U

X

X

T

T

Coupure double brins

Uracile

Modification de la base

Alkylation

Dimère de Pyrimidine

O6 methyl guanosine

Petites lésions:modifient la structure chimique des composants de l’ADN mais ne déforment pas la double hélice

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE L’ADN

Site abasique

Adduits volumineux

Pontages intra et inter-brin

mésappariement

X

X

X

X

X

X

C

G

A

CH3

(CH3)n

U

X

X

T

T

Coupuredouble brins

Uracile

Modification de la base

Alkylation

Dimère de Pyrimidine

O6 methyl guanosine

Lésions volumineuses: modifient la structure chimique des composants de l’ADN et déforment la double hélice

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Introduction: la réparation de l’ADN

LES DIFFÉRENTS VOIES DE RÉPARATION DE L’ADN

BER

NER

NHEJ / HR

MMR

DR

X

X

X

X

X

X

C

G

A

CH3

(CH3)n

U

X

X

T

T

BER: Base Excision Repair

NER: Nucleotide Excision Repair

NHEJ: Non-Homologous End joining

HR: Homologous Recombination

MMR: MisMatch Repair

DR: Direct Reversal

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NER

BER

Base Excision Repair

Nucleotide Excision Repair

GG et TC-NER

Glycosylases

Reconnaissance du dommage

XPC, (XPE), XPA and TFIIH

Glycosylases + AP endonucléase

Excision du dommage

Endonucléases XPG et XPF-ERCC1, XPA

Resynthèse de l’ADN

Polymérase β + Polymérases δ, ε

Polymérases δ, ε, RPA, XPA?

Ligase III ou I

Ligature

Ligase I

Introduction: la réparation de l’ADN

LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER

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Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES ADN N-GLYCOSYLASES ET L’APE1

  • Substrats: petites lésions de l’ADN

  • Fonction des ADN N-glycosylases: coupure de la liaison N-Glycosidique

  • Spécificité des ADN N-Glycosylases: un type de dommage ou un groupe de dommages

  • Exemple d’ADN N-Glycosylases: UNG (Uracile), OGG1 (8-oxoG), NTH1 (Diol de Thymine, 5 Formyluracile), NEIL1 (Diol de Thymine, Fapy-A, Fapy-G, 8-oxoG)

  • Fonction de APE1 et des ADN N-Glycosylases bifonctionnelles : coupure de la liaison phosphodiester

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES RÔLES DE XPA ET XPC

  • Substrats: lésions volumineuses de l’ADN

  • XPC:

    • Spécificité d’intervention: uniquement réparation globale du génome

    • Fonction: Reconnaissance de l’ADN endommagé (1er facteur à intervenir)

  • XPA:

    • Spécificité d’intervention: réparation globale du génome et réparation couplée à la transcription

    • Interactions avec d’autres facteurs de la NER: TFIIH, ERCC1 et RPA

    • Fonction(s): « Chef d’orchestre » de la NER: de la reconnaissance du dommage à la resynthèse de l’ADN

    • = Rôle complexe qui reste encore à clarifier

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION

BER

NER

  • Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997)

  • XPC stimule activité de la TDG(Schimizu et al., 2003), OGG1(d’Errico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008)

  • hHR23 (A et B) stimule MPG(Miao et al., 2000)

  • RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000)

  • XPG stimule NTH1(Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999)

  • Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydatif que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)


Anne laure raffin

Introduction: la réparation de l’ADN

LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION

BER

NER

  • Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997)

  • XPC stimule activité de la TDG(Schimizu et al., 2003), OGG1(d’Errico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008)

  • hHR23 (A et B) stimule MPG(Miao et al., 2000)

  • RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000)

  • XPG stimule NTH1(Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999)

  • Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydant que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008)


Anne laure raffin

Introduction: le Xeroderma pigmentosum

LES CARACTÉRISTIQUES DU XERODERMA PIGMENTOSUM

  • 1968: relation XP – déficience de la NER (Cleaver 1968)

  • 7 groupes XP (A à G): déficience d’une protéine de la NER + XPV

  • Hypersensibilité aux UV : apparition de lésions pigmentaires dès le plus jeune âge

  • Apparition cancer: risque multiplié par 1000. Tumeurs de la peau vers l’âge de 8 ans (Daya-Grosjean et al. 1995)

  • Certaines formes: troubles neurologiques

  • Espérance de vie: 15-20 ans (XP classiques)(de Boer and Hoejmakers 2000)

  • Pas de traitement

  • Diagnostic: test UDS (Unscheduled DNA Synthesis)

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Vision minimaliste de la réparation de l’ADN: une lésion étudiée à la fois

Test in vitro sur support permettant une mesure conjointe de la réparation de plusieurs lésions à partir d’un seul lysat cellulaire

Introduction: Les outils pour étudier la réparation

LES AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES TESTS DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Objectifs

LES OBJECTIFS DE L’ÉTUDE

  • Proposer un outil de diagnostic de la maladie XP alternatif à l’UDS

    • Fiabilité

    • Rapidité

    • Sensibilité

    • Peu de cellules

    • Utiliser l’outil « puce réparation » pour caractériser des phénotypes de réparation de l’ADN de lignées XP

  • Etudier la réparation de l’ADN de lignées XPA et XPC

    • Quel est le niveau basal de réparation? Influence de la concentration protéique

    • Quelle est la réponse à un traitement génotoxique? UVB

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Tampons ioniques

Protéines

dosage

Test in vitro de la réparation

Matériels et Méthodes

LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES

3 à 5 x 106 cellules

(Test en solution de Wood et al.: 109 cellules)

Congélation

DMSO+SVF+milieu

Fibroblastes SV40 de patients XP

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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lésions

plasmide

surface de la biopuce

incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5

Excision des lésions + Resynthèse

Gain de fluorescence

Matériels et Méthodes

[support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!!

LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION

Puce Plasmide

Puce Oligo

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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AT CTAGCATGGCC

Adduits

Cisplatine

G

G

NH2

Pt

TACGA CGT CCGG

NH2

Sites abasiques

T-T CPD

+

8oxoGuanine

Diols de pyrimidine

O

H

O

H

6-4 PP

O

H

N

N

N

+

N

O

N

N

N

N

N

N

R

R

Bases alkylées

Photoproduits

Matériels et Méthodes

LES LÉSIONS DE LA PUCE PLASMIDE

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Part relative de l’intensité de fluorescence des différentes lésions

Soustraction du contrôle

Somme des Intensité de fluo pour la même lésion

Profil d’ER

(Excision-Resynthèse)

Matériels et Méthodes

PARAMÈTRES MESURÉS

Quantification de la fluorescence totale

Phénotype de réparation

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

lésions

plasmide

surface de la biopuce

fluorophore Cy3

lésions

oligonucléotide

surface de la biopuce

incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5

incubation avec

lysat cellulaire

Excision des lésions + Resynthèse

Excision des lésions

Perte de fluorescence

Gain de fluorescence

Matériels et Méthodes

[support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!!

LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION

Puce Plasmide

Puce Oligo

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Matériels et Méthodes

LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES MESURÉES AVEC LA PUCE OLIGO

  • - NTH1: Diol de thymine, Dihydrothymine

  • NEIL1?: Diol de thymine, Dihydrothymine

  • UNG: Uracile (U-A ou U-G)

  • SMUG1: Uracile (U-A ou U-G)

  • TDG: Mésappariement G-T

  • MBD4: Mésappariement CG-GT

  • MPG: Ethénoadénine

  • APE1: THF (équivalent site abasique)

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Niveau basal de réparation

PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (1)

Lysat témoin

0,3 mg/mL

  • Déficience pour la réparation des lésions prises en charge par la BER et la NER

Implication de la protéine XPC dans la réparation des petites lésions

Phénotype XPC ≠ Phénotype Témoin

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Niveau basal de réparation

PHÉNOTYPE D’EXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (2)

Lysat témoin

0,3 mg/mL

Phénotype XPA = Phénotype Témoin à cette concentration protéique

Rôle de XPA dans la réparation de la 8-oxoG? Pas de rôle établi dans la littérature (Klein et al., 1992; Dusinska et al., 2006 ≠ Rünger et al., 1995)

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Niveau basal de réparation

PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DE L’ADN DE LYSATS TOTAUX

Lysat témoin

  • ER XPC = 85 % du témoin

  • ER XPA = 100 % du témoin

La discrimination des phénotypes XP est encore plus difficile avec les lysats totaux

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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  • Le lysat XPA excise les diols de thymine avec une plus faible efficacité que le lysat témoin: interaction XPA avec NTH1, NEIL1?

Résultats: Niveau basal de réparation

PHÉNOTYPE D’EXCISION DE LYSATS NUCLÉAIRES

- Activités glycosylases et APE1 équivalentes dans tous les lysats testés sauf pour l’excision des diols de thymine

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Résultats: Niveau basal de réparation

CONCLUSIONS NIVEAU BASAL DE RÉPARATION

  • Niveau basal + concentration standard de protéines

    • XPC < Témoin

    • XPA = Témoin

  • XPC joue un rôle dans la réparation des petites lésions

  • BER et XPA?

?

Faire varier des paramètres expérimentaux pour gagner de l’information

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB

Exposition des cellules aux UVB (attention à la confluence)

0, 5 et 20 J/m²

24 h

Cycle cellulaire

(Cytométrie en flux)

Réparation de l’ADN

(test in vitro d’ER)

Cytotoxicité

(test MTT)

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Effet d’une irradiation UVB

CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB

Les cellules XP sont plus sensibles aux UVB

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

0 J/m²

5 J/m²

20 J/m²

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB

0J/m²

20J/m²

**

**

Fibroblastes

**

*

*

*

*

**

**

**

**

20J/m²

20J/m²

0J/m²

0J/m²

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

0 J/m²

5 J/m²

20 J/m²

5 J/m²

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB

**

**

Fibroblastes

**

*

*

*

*

**

**

**

**

  • Les cellules XP réagissent différemment des cellules témoin suite aux UVB

  • XPC  XPA

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H)

Stimulation

Inhibition

Après l’irradiation UVB des cellules :

  • Stimulation de l’ER avec le lysat nucléaire témoin

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H)

Stimulation

Inhibition

Après l’irradiation UVB des cellules :

  • Peu ou pas d’effet de l’irradiation sur la réparation des lysats XP

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Résultats: Effet d’une irradiation UVB

CONCLUSIONS RÉPONSE AUX UVB

Rappel: Sans irradiation, XPA = Témoin

  • UVB + concentration standard de protéines

    • Stimulation des activités d’ER avec le lysat nucléaire témoin

    • Pas de stimulation pour les lysats XP

  • Meilleure discrimination des phénotypes de réparation après un traitement préalable des cellules

  • Translocation des protéines de réparation vers le noyau en réponse à un traitement génotoxique: XPA (Wu et al., 2007), XPD (Fung et al., 2008)

  • Néo-synthèse des protéines de la réparation en réponse à l’irradiation UV

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Effet de la concentration protéique

EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (1)

Lysat nucléaire témoin

0,9 mg/mL protéines

0,3 mg/mL protéines

  • Plus de protéines: cinétique différente suivant les lésions (vitesse initiale, plateau, allure biphasique)

Mécanismes différents suivant la concentration?

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Effet de la concentration protéique

EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (2)

Lysat nucléaire témoin

0,3 mg/mL

0,9 mg/mL

Augmentation de la part relative d’ER des photoproduits, des adduits du cisplatine et de la 8-oxoG

Activités NER et réparation de la 8-oxoG favorisées à forte concentration

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Lysat XPA

Lysat témoin

  • Nette diminution du niveau relatif de réparation de XPA à partir de 0,7 mg/mL (sauf pour les diols de pyrimidine)

Résultats: Effet de la concentration protéique

EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LES PHÉNOTYPES DE RÉPARATION XP

Lysat XPC

Lysat témoin

pCPD-64 p8oxoGpAlkB pCisPpAbaSpGlycol

  • Léger effet de la concentration sur le niveau relatif d’ER du lysat nucléaire XPC pour les photoproduits, les adduits du cisplatine et la 8-oxoG

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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Résultats: Effet de la concentration protéique

CONCLUSIONS EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE

Rappel: avec peu de protéine, XPA = Témoin

  • Niveau basal + beaucoup de protéines

    • Meilleure efficacité des activités NER et de réparation de la 8-oxoG

    • Peu d’effet de la concentration sur le profil relatif de XPC

    • Effet de la concentration sur le profil relatif de XPA

  • Meilleure discrimination des phénotypes XP à fortes concentrations protéiques

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Résultats

DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (1)

  • Nos tests in vitro d’excision-resynthèse et d’excision permettent d’appréhender la réparation de l’ADN comme un réseau enzymatique dynamique et complexe

  • Le niveau basal avec la concentration standard est à considérer: il apporte de nouvelles informations quant aux régulations et mécanismes mis en jeu à de telles concentrations protéiques. Que se passe-t-il in vivo?

  • Les niveaux de réparation obtenus pour XPA et XPC sont supérieurs à ceux de la littérature obtenus avec d’autres méthodes de mesure in vivo(Athas et al., 1991; Cleaver 2005) et in vitro (Masutani et al., 1993)

  • Les ratiosProtéines / ADNouProtéines / Lésionssont des paramètres à prendre en considération lors des tests in vitro

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Activités NER limitantes? A quoi est dû le niveau basal?

1. Niveau basal + concentration protéique standard

Discrimination difficile

Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG: Implication des facteurs XP dans la réaction d’ER

2. Irradiation UVB

3. Augmentation de la concentration protéique

Discrimination possible

Résultats

DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (2)

?

Stimulation de la réparation en réponse aux UVB

Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG à forte concentration

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

PLAN

  • Introduction

    • La réparation de l’ADN

    • Le Xeroderma pigmentosum

    • Les outils pour étudier la réparation de l’ADN

  • Objectifs

  • Matériels et Méthodes

    • Préparation des lysats cellulaires

    • Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo

  • Résultats

    • Le niveau basal de réparation

    • Réponse à une irradiation UVB

    • Effet de la concentration protéique sur le phénotype d’ER

  • Conclusions et perspectives

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Informations complémentaires

Conclusions et perspectives

BILAN: TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA RÉPARATION DE L’ADN

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

DIAGNOSTIC ?

Niveau basal avec concentration protéique standard: faible discrimination des phénotypes XP

Irradiation des cellules au préalable

Augmentation de la concentration protéique

Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC

Conclusions et perspectives

APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (1)

  • Approfondir l’étude à tous les groupes de complémentation, de A à G

  • Approfondir les phénotypes et arriver à déterminer une signature de la réparation de l’ADN pour chaque groupe XP pour pouvoir clairement les identifier

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Conclusions et perspectives

APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (2)

  • Tester des petites molécules: M1

[M1]= 0,1 mM

[Lysat nucléaire]= 0,7 mg/mL

M1 0 mM

  • Profil de XPC très différent de XPA

  • En utilisant des petites molécules, il serait possible de discriminer facilement les différents groupes de complémentation?

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Conclusions et perspectives

PERSPECTIVES

  • Fibroblastes primaires: Confirmer les résultats obtenus à partir des lignées

  • Amélioration du test : nature des lésions (photoproduits: séparer les CPDs des 6-4 PPs)

  • Comprendre la signification du niveau basal

  • Approfondir l’effet de la concentration sur les activités de réparation (lysats totaux, autres groupes de complémentation)

  • Rôle de XPA dans la réparation des dommages oxydatifs? Hypothèse: Relation avec les troubles neurologiques développés par ces patients

  • Echantillon: arriver à travailler à partir d’un prélèvement sanguin?

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Remerciements

Sylvie Sauvaigo

Zohra Termache

Sylvain, Francette, Jocelyne, Gwenaëlle

… Et tout le LAN

Laboratoire FRE 29-39, IGR, Stabilité génétique et oncogenèse (Pr. Alain Sarasin)

Laboratoire CEA, Stabilité génétique et oncogenèse (Dr. Denis Biard)

Laboratoire CEA, Plateforme cytométrie en flux, iRTSV (Véronique Collin-Faure, Serge Candéias)

CEA, INSTN, Contrat de Formation par la Recherche

MERCI!

Florence Pivard et Sandrine Bessette, stagiaires ESTBB en 2007 et 2008

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


Anne laure raffin

Partie

TITRE DE DIAPO

Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009


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