第二章 基因工程制药

1. 第二章 基因工程制药

2. 第一节 概 述第二节 目的基因的获得第三节 基因表达第四节 基因工程菌的不稳定性第五节 基因工程菌中试第六节 重组工程菌的培养第七节 基因工程药物的分离纯化第八节 变性蛋白的复性第九节 基因工程药物的质量控制 第二章 基因工程制药

3. 第一节 概 述 一、基因工程技术生产药品的优点 二、基因工程药物生产的基本过程 三、国内外基因工程药物研究进展

4. 第一节 概 述 基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展 基因工程： 应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物 遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品 和服 务的技术。

5. 一、基因工程技术生产药品的优点 1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。 3. 开发更多的内源性生理活性物质。 4. 通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优 化天然的生理活性物质。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 6. 降低成本，提高产品质量。

6. 二、基因工程药物生产的基本过程 1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验

8. 三、国内外基因工程药物研究进展 目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子 表皮生长因子、凝血因子； 3. 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4. 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激 活剂、超氧化物歧化酶等。

9. Vitamin A

10. 第二节 目的基因的获得 一、 反转录法 二、化学合成法

11. 一、反转录法 1．mRNA的纯化 （1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。 （2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）

12. 一、反转录法 2．cDNA第一链的合成（RT-PCR，随机引物） 3．cDNA第二链的合成 4．cDNA克隆 5．将重组体导入宿主细胞

13. 一、反转录法 6．cDNA文库的鉴定

14. 一、反转录法 7．目的cDNA克隆的分离和鉴定

15. 二、化学合成法 优点：准确性高、人工接头、改进、利用 局限性： 1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高

16. 第三节 基因表达 Vitamin B2 基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。

17. 一、宿主菌的选择 1. 原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等） 2. 真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）

18. 一、宿主菌的选择 1．原核细胞 （1）大肠杆菌 优点：遗传背景清晰，生长迅速。 缺点：①胞内表达，提取困难。 ②包含体形式，需复性。 ③表达后不存在修饰作用，应用受限。 ④翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子 编码）容易引起免疫反应。 ⑤大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。 ⑥蛋白酶水解作用破坏产物。

19. 一、宿主菌的选择 1．原核细胞 （2）枯草芽孢杆菌 优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。 缺点：蛋白酶水解活性更强。 （3）链霉菌 优点：①不致病 ②分泌能力强 ③具有糖基化能力 缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差

20. 一、宿主菌的选择 2．真核细胞 （1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。 （2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。 （3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。

21. 二、大肠杆菌中的基因表达 1．载体 表达载体必须具备下列条件： ①载体能独立复制 ②具有多克隆（MCS）位点和标记基因 ③具有很强的启动子 ④具有调节基因 ⑤具有很强的终止子 ⑥具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力

22. 二、大肠杆菌中的基因表达 基因工程药物研究中常用的表达载体 （1）PBV220系统 ①PL、PR串联启动子，增强启动信号。 ②rrnB基因的终止信号。 ③PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。 ④CITS857抑制子基因（温控诱导） ⑤质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因

23. 二、大肠杆菌中的基因表达 PBG-2: 由PBV220衍生,可以表达与 IgG结合的融合蛋白，并且是有蛋 白剪切位点，便于表达后纯化及 纯化后剪切。

24. 二、大肠杆菌中的基因表达 （2）PET系统 ①IPTG诱导（异丙基-硫代-D-半乳糖苷） ②多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点，切开后粘性末端为 ATG，便于外源基因插入表达。 ③在外源基因的N末端可融合6个His，便于纯化。

25. 二、大肠杆菌中的基因表达 2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响

26. 二、大肠杆菌中的基因表达 3．表达形式 （1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。

27. 三、酵母中的基因表达 1．载体 ①YEP类（酵母附加体质粒） 由大肠杆菌质粒，2μm质粒和Trp或URA3组成， ARS来自2μm质粒。 ②YRP（酵母复制型质粒） ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。 ③YCP（酵母着丝粒型质粒） 除具有YRP元件外，还具有着粒成份。

28. 三、酵母中的基因表达 ④YIP（酵母整合型质粒） 含有可与染色体进行同源重组的序列 ⑤酵母表达型质粒 ⑥分泌型表达质粒 带有控制蛋白质分泌的信号序列

29. 三、酵母中的基因表达 2．影响目的基因在酵母中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）TATA盒启动子成分 （3）分泌信号序列 （4）终止序列 （5）翻译后修饰 （6）对宿主影响

30. 第四节 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象， 质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。

31. 一、质粒不稳定产生的原因： 1. 质粒的分裂不稳定性： 指工程菌分裂时出现一定比列不含质粒的子代菌的现象。 主要与两个因素有关： （1）含质粒菌产生不含质粒子代的频率，质粒丢失率与 宿主菌、质粒特性和培养条件有关。 （2）含质粒菌与不含质粒菌比生长速率的差异的大小。 2. 质粒的结构不稳定性： 指DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

32. 二、提高质粒稳定性的方法 1. 选择合适的宿主菌 2. 选择合适的载体 3. 选择压力 4. 分阶段控制培养 5. 控制培养条件 6. 固定化

33. 第五节 基因工程菌中试 一、工程菌选择 二、反应器（发酵罐）设计 三、发酵培养基组成 四、工艺最佳化与参数监测控制

34. 第六节 重组工程菌的培养 一、基因工程菌的培养方式 二、基因工程菌的培养工艺 三、基因工程菌的培养设备

35. 第七节 基因工程药物的分离纯化 基因工程产品纯化前的性质： ①目的产物在体系中含量较低 ②体系中组份复杂（细胞、代谢物、残留培养基及无机盐等） ③目的产物稳定性差：对pH、温度、金属离子、有机溶剂、 剪切力、表面活性剂等十分敏感，容易失活、变性。

36. 一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 1. 含目的产物的初始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素 均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包括： （1）菌种类型、形式，各种生物学性质，产物和副产物种类、 产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体）， 代谢物种类，产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等； （2）原材料和培养基的来源及质量是否稳定； （3）生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式(连续、批 式、半连续)，生产周期，生产能力，工艺控制条件及方式等； （4）初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质 种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性 质和热力学性质等。

37. 一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 2. 物料中杂质种类和性质 物料中杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、 化学性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、 稳定性(对热、pH、盐、有机溶剂等)、溶解度、分配系数、挥发性 及吸附性能等。

38. 二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 3. 目的产物的特性 目的产物特性主要有产物的化学、物理和生物学特性。 包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性(对热、冷冻、pH、盐、有机溶剂和金属离子等)、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物活性、亲和性、配基种类、表面活性等。

39. 二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 4. 产品质量要求 产品质量要求主要包括产品质量指标，产品用途，对纯度、生 物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质 的种类和最大允许量，以及对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性 等。

40. 二、分离纯化的基本过程 基因工程药物的分离纯化一般包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初 步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工等步骤。

41. 二、分离纯化的基本过程

42. 分离纯化的技术特点： ①条件温和 ②选择性好 ③收率要高 ④纯化过程快速

43. 三、细胞的破碎方法 1. 细胞收集 2. 细胞破碎 物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、 超声破碎法、高压挤压法 化学破碎法：渗透冲击、增溶法、 脂溶法 生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 壳多糖酶等）

44. 超声破碎法

45. 四、固液分离 • 分离细胞碎片常用的方法有： • 离心沉淀：高速离心、超速离心 • 膜过滤：微滤、超滤和反渗透 • 双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖 • 聚乙二醇-无机盐

46. 五、重组蛋白质的分离纯化 分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括： 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。

47. 五、重组蛋白质的分离纯化 1. 离子交换层析： 是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。 pH、两性分子、侧链、

48. 五、重组蛋白质的分离纯化 2. 疏水层析： 是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 疏水层析最常用填料是多聚糖（如琼脂糖）及硅胶。 利用氨基酸侧链的疏水键。

49. 五、重组蛋白质的分离纯化 3. 亲和层析： 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

50. 五、重组蛋白质的分离纯化 4. 凝胶过滤层析： 又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。 大分子先从色谱柱中流出