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Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers PowerPoint PPT Presentation


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Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers. INRA Nancy Unité de recherche Pathologie Forestière. Claude Husson , Pascal Frey, Jean Pinon. moins de 1 000 ha. de 1 000 à 2 500 ha. de 2 500 à 5 000 ha. plus de 5 000 ha.

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Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers

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Presentation Transcript


Slide1 l.jpg

Deux méthodes de diagnostic moléculairedes espèces de Melampsora,agents de la rouille foliaire des peupliers

INRA Nancy

Unité de recherche Pathologie Forestière

Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon


Les peupleraies l.jpg

moins de 1 000 ha

de 1 000 à 2 500 ha

de 2 500 à 5 000 ha

plus de 5 000 ha

Les peupleraies

230 000 ha

1,3% de la surface boisée

2,2 millions m3 par an ( chêne)

culture clonale :

monoclonale / parcelle

pauciclonale / région


La rouille foliaire des peupliers l.jpg

urédospores

urédies

Pertes économiques importantes

La rouille foliaire des peupliers

Agents pathogènes : Melampsora spp. (Basidiomycètes, Urédinales)

Dégâts:

  • défeuillaison intense

  • réduction de croissance

  • affaiblissement général


En france 3 esp ces de melampsora sont pathog nes sur les peupliers cultiv s l.jpg

M. larici-populina,la plus fréquente et la plus agressive

M. allii-populina, présente partout en France

M. medusae, parasite de quarantaine, essentiellement dans leSud-Ouest de la France

Nord+Est

Centre

Ouest

Sud-Ouest

En France, 3 espèces de Melampsora sont pathogènes sur les peupliers cultivés :


Cycle de la rouille du peuplier l.jpg

1 cm

1 cm

1 mm

urédies

écidies

hôte alternant

(mélèze)

hôte principal

(peuplier)

télies

  • télien

  • écidien

morphologie très proche entre espèces

morphologie distincte entre espèces

détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire

  • urédien

Cycle de la rouille du peuplier

Identification des espèces à différents stades de développement :


Slide6 l.jpg

M. larici-populina (30 isolats)

M. larici-populina

M. allii-populina (28 isolats)

88 isolats étudiés

M. allii-populina

M. medusae (30 isolats)

M. medusae

M. medusae

Origine géographique des isolats étudiés


Les deux outils de biologie mol culaire utilis s l.jpg

Région ITS (Internal Transcribed Spacer) de l’ADN ribosomal

I - Analyse de la formation d’hétéroduplex

M. larici-populina

M. allii-populina

M. medusae

II - Trois couples d’amorces spécifiques des espèces :

100 pb

5,8S

ITS2

25S

17S

ITS1

ITS4-MLP

ITS4-MAP

ITS4-MM

ITS1-MLP

ITS1-MM

ITS1

ITS4

ITS1-MAP

Les deux outils de biologie moléculaire utilisés


I analyse par formation d h t roduplex principe l.jpg

Espèce à déterminer

ITS amplifiés

(amorces ITS1 / ITS4)

3 ITS de

référence

M. medusae

M. larici-populina

M. allii-populina

dénaturation

à 94°C

renaturation

jusqu’à 25°C

homoduplex

et

hétéroduplex

homoduplex

et

hétéroduplex

I - Analyse par formation d’hétéroduplex :PRINCIPE

homoduplex


I analyse par formation d h t roduplex mise en evidence l.jpg

Révélation sur gel d’acrylamide à 8%

M : marqueur de taille (100 pb)

MLP : M. larici-populina

MAP : M. allii-populina

MM : M. medusae

MLP

+

MM

MAP

+

MAP

MLP

+

MAP

MLP

+

MLP

MM

+

MM

MAP

+

MM

M

hétéroduplex

700 pb

Révélation sur gel d’agarose à 1%

MLP

+

MM

MAP

+

MAP

MLP

+

MAP

MLP

+

MLP

MM

+

MM

MAP

+

MM

M

hétéroduplex

homoduplex

I - Analyse par formation d’hétéroduplex : MISE EN EVIDENCE

homoduplex


Slide10 l.jpg

CONCLUSIONS :

  • méthode moléculaire simple et fiable pour l’identification des espèces

I - Analyse par formation d’hétéroduplex

RESULTATS :

Confrontations des ITS amplifiés des urédospores des 88 isolats avec les 3 ITS de référence

  • Formation d’hétéroduplex dans 100% des confrontations interspécifiques

    (ITS hétérologues)

  •  Absence d’hétéroduplex dans 100% des confrontations intraspécifiques

  • (ITS homologues)

  • gel d’agarose bien adapté au diagnostic interspécifique en routine

  • méthode indirecte d’analyse du polymorphisme de séquence

  • pourcentage d’homologie intraspécifique des ITS supérieur à 95%


Ii amorces sp cifiques d esp ces resultats et conclusions l.jpg

M. larici-

populina

M. allii-

populina

M.

medusae

ITS1-MLP / ITS4-MLP

Validation sur l’ADN d’urédospores de 88 isolats :

M

1

8

9

T

4

5

6

7

2

3

  • Les couples d’amorces spécifiques d’espèce permettent l’amplification de l’ADN de 100% des isolats de l’espèce correspondante

ITS1-MAP / ITS4-MAP

La spécificité des amorces est confirmée

Outil d’identification des 3 espèces de Melampsora très fiable

ITS1-MM / ITS4-MM

ITS1 / ITS4

II - Amorces spécifiques d’espèces : RESULTATS ET CONCLUSIONS

  • Aucune réaction croisée entre ces 3 espèces n’a été observée


1 identification d une esp ce diff rents stades du d veloppement l.jpg

cas de M. larici-populina :

télies sur peuplier

écidies sur mélèze

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS

1- identification d’une espèce à différents stades du développement

  • Validation du couple d’amorces sur ces deux stades

  • Pas de réaction croisée avec l’ADN de l’hôte


Slide13 l.jpg

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS

2 - détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaireau stade urédien (peuplier) :

cas de M. medusae en mélange avec M. larici-populina

  • M. medusae

    - parasite de quarantaine

    - espèce peu fréquente

    - répartition géographique mal expliquée : Sud-Ouest de la France

  • M. larici-populina

    - espèce très majoritaire en France


2 d tection d une esp ce rare en m lange dans une esp ce majoritaire l.jpg

[ ADN M. medusae ]

600 pb 

 Détection de M. medusae dans une solution à 0,1 pg / µl

0,5

pg/µl

10

pg/µl

0,1

pg/µl

0,05

pg/µl

1

pg/µl

10

ng/µl

0,1

ng/µl

1

ng/µl

T

M

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS

2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire

Mélanges d’ADN de M. medusae et de M. larici-populina (10 ng/µl)

utilisation des amorces spécifiques de M. medusae

 Seuil de détection de 1 / 100 000

soit l’équivalent de la quantité d’ADN de 6 urédospores

dans le mélange


Slide15 l.jpg

Dilution en cascade

Nombre de spores

de M. medusae

64000

6400

640

64

6

3

0

600 pb 

 Détection de 6 urédospores de M. medusae parmi

800 000 urédospores de M. larici-populina

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS

2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire

Mélanges de SPORES de M. medusae et de M. larici-populina

(extraction de 2 mg de chaque mélange = 800 000 spores)

 Seuil de détection inférieur à 1 / 100 000

 Possibilité de détecter une seule urédie de M. medusae sur 100 feuilles de peuplier très infectées par M. larici-populina


Slide16 l.jpg

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Les amorces spécifiques d’espèces ont montré leur efficacité :

 pour l’identification de l’espèce quel que soit le stade de développement

 identification des espèces sur écidies : efficacité du passage

de M. larici-populina sur mélèze

 la détection d’une espèce rare (amorces >>>> microscope)

 application pour le contrôle du parasite de quarantaine M. medusae,

effectué par le LNPV

Construction d’amorces spécifiques des 5 espèces de Melampsora

des trembles :

 certaines ont pour hôte altenant le mélèze

 l’identification au microscope est très difficile, même au stade urédien


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