FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia

1. FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALICorso di Laurea Magistrale in Neurobiologia EFFETTI PRODOTTI DALLA STIMOLAZIONE DEL RECETTORE MUSCARINICO M2 IN LINEE DI NEUROBLASTOMA UMANO Relatore: Prof.ssa Ada Maria Tata Candidato: Francesca Mattei

2. Il Neuroblastoma umano • Tumore embrionale del Sistema Nervoso Periferico (SNP) • Il 97% dei casi sono diagnosticati in età infantile • Età media della diagnosi: 22 mesi • Responsabile dell’7-8% dei tumori pediatrici • Incidenza: 10 casi per milione per anno • M:F = 1,1 : 1 • Più del 60% dei Neuroblastomi sono metastatici • Diagnosi: presenza di caratteristiche istopatologiche del tessuto tumorale; presenza di cellule tumorali nei campioni bioptici e elevate concentrazioni di catecolamine nelle urine. • Terapie: chemioterapia; intervento chirurgico ed eventuale radioterapia locale.

3. Stadiazione Nel 1984 Shimada ha presentato uno schema classificativo che mette in realazione gli aspetti isto-patologici del tumore con il comportamento clinico.

4. La maggior parte dei neuroblastomi sono diagnosticati nell’addome e sono associati con: • Ghiandole surrenali • Gangli simpatici E’ ORMAI ACCETTATA L’IPOTESI CHE LE CELLULE DI ORIGINE DEL NEUROBLASTOMA DERIVINO DALLA LINEA SIMPATICO-SURRENALE DELLA CRESTA NEURALE DURANTE LO SVILUPPO

5. Popolazione cellulare multipotente embrionale • Cellule con capacità migratoria; durante lo sviluppo vanno ad invadere molti siti embrionali dando origine ad una varietà di tipi cellulari: LA CRESTA NEURALE Circa il 65% dei neuroblastomi insorgono nella midollare del surrene o nei gangli simpatici lombari.

6. I pathwaydi Notch ed EGFR EGFR: recettori transmembrana. Modulano processi di proliferazione. Notch: recettori transmembrana. Modulano proliferazione, differenziamento ed apoptosi Ctrl Egf Nel Neuroblastoma, l’attivazione costitutiva del signaling di Notch inibisce processi differenziativi. Ho R et al. [2005]. Cancer. Res.

7. L’ Acetilcolina • E’ stata la prima molecola ad essere identificata come neurotrasmettitore; • Durante l’embriogenesi agisce come morfogeno coinvolto nel controllo della migrazione cellulare, della proliferazione; • Modula la neurogenesi controllando la proliferazione di cellule staminali e dei progenitori.

8. I recettori colinergici L’ACh lega due tipi di recettori: la famiglia ionotropica di recettori nicotinici e la famiglia metabotropica di recettori muscarinici. Recettore nicotinico Recettori muscarinici

9. Recettori muscarinici e tumori

10. Il recettore muscarinico M2 Agonisti non selettivi Agonista M2 • Acetylcholine • Carbachol Recettore M2 e Neuroblastoma ArecaidinePropargylEster • Pilocarpine Arecoline

11. Modello sperimentale SH-SY-5Y SK-N-SH • La linea SK-N-SH è stata isolata da una biopsia di midollo osseo di una paziente dell’età di 4 anni. • Caratteristiche epiteliali; assume morfologia neuronale se trattata con acido retinoico • La linea SH-SY-5Y è un subclone della linea cellulare SK-N-SH. • Presentano caratteristiche neuronali. Entrambe le linee cellulari sono caratterizzate da un’elevata attività degli enzimi tirosina-idrossilasi e dopamina- β-idrossilasi.

12. Obiettivo della ricerca Caratterizzazionedell’espressionedeirecettorimuscarinici Valutazionedeglieffettidovutiall’attivazione del recettoremuscarinicoM2 nelle due lineecellularidiNeuroblastoma Proliferazione e sopravvivenza • Cross talk trailrecettoreM2 e Notch,e traM2ed EGFR • Migrazionecellulare

13. Caratterizzazione dei recettori muscarinici RT-PCR Western Blot M1 M2 M3 M4 M5 18 s 234pb 160pb 236pb 160pb 217pb 86pb SK-N-SH M1 M2 M3 M4 M5 18 s 234pb 160pb 236pb 160pb 217pb 86pb SH-SY-5Y

14. Effetti dell’arecaidina sulla proliferazione nella linea SK-N-SH Saggio MTT TrypanBlue Are 24h Are 48h Ctrl

15. Effetti dell’arecaidina sulla proliferazione nella linea SH-SY-5Y Saggio MTT TrypanBlue Ctrl Are 48h Are 24h

16. Effetti dell’arecaidina sulla proliferazione (c- Myc) Western Blot Ctrl Are 24h Are 48 h Ctrl Are 24h Are 48 h c-MYC c-MYC SK-N-SH SH-SY-5Y GAPDH GAPDH

17. Effetti dell’arecaidina sulla proliferazione (Rescue) SK-N-SH SH-SY-5Y

18. Effetti dell’arecaidina sulla proliferazione: Conclusioni L’ arecaidina, attraverso l’attivazione del recettore muscarinico M2, in entrambe le linee cellulari di Neuroblastoma umano, esercita Un’ inibizione reversibile della proliferazione cellulare

19. Effetti dell’arecaidina sul pathwayNotch nelle SK-N-SH Ctrl Are 24h Are 48 h Ctrl Are 24h Are 48h NOTCH-1 RT-PCR Western Blot Notch-1 GAPDH 18s

20. Effetti dell’arecaidina sul pathwayNotch nelle SH-SY-5Y Ctrl Are 24h Are 48 h Ctrl Are 24h Are 48 h NOTCH-1 RT-PCR Western Blot Notch-1 GAPDH 18s

21. Effetti dell’arecaidina sul fattore di trascrizione Hes-1 RT-PCR Ctrl Are 24h Are 48 h Ctrl Are 24h Are 48 h SK-N-SH SH-SY-5Y Hes-1 Hes-1 18s 18s

22. Effetto dell’arecaidina sul pathwayEGFR SK-N-SH Ctrl Are 24h Are 48 h Ctrl Are 24h SH-SY-5Y EGFR Egfr GAPDH 18 s RT-PCR Ctrl Are 24h Egfr SH-SY-5Y 18 s Western Blot

23. Effetti dell’arecaidina sulla migrazione nelle SK-N-SH (WoundHealing) Ctrl 0h Ctrl 16h Serum Free Arecaidina Mitomicina C

24. Effetti dell’arecaidina sulla migrazione nelle SH-SY-5Y(WoundHealing) Ctrl 0h Ctrl 16h Serum Free Mitomicina C Arecaidina

25. Conclusioni Nelle due linee di Neuroblastoma umano (SK-N-SH e SH-SY-5Y), l’attivazione del recettore M2 attraverso l’agonista Arecaidina, causa un blocco reversivibile proliferativo, probabilmente mediato dalla dis-regolazione di Notch e EGFR. In entrambe le lineecellulari non siosservanoalterazionisullasopravvivenzacellulare. L’attivazione del recettoremuscarinicoM2sembrerebbeprocurare un ritardonellamigrazionecellulare.

26. Conclusioni • Gli effetti mediati dal recettore M2 nelle cellule di Neuroblastoma umano sono meno drammatici rispetto a quelli osservati nei glioblastomi • In futuro si potrebbero valutare gli effetti congiunti del recettore M2 con farmaci antitumorali (cisplatino) per vedere se l’effetto dell’attivazione del recettore muscarinico d’interesse possa rendere le cellule di Neuroblastoma più sensibili ai trattamenti con i chemioterapici convenzionali.

27. Ringraziamenti • Prof.ssa Ada Maria Tata • V. Orlando • M. Di Bari, I. Cristofaro, F. Alessandrini, R. Piovesana, F. Favarolo e tutti i colleghi del laboratorio 221, 222A e 222B. Grazie a voi per l’attenzione!!!