Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej
Download
1 / 1

Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej - PowerPoint PPT Presentation


  • 171 Views
  • Uploaded on

Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz Opiekun pracy: dr Ewa Poboży. Ignacy Rzygaliński. Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej. Wprowadzenie. ABTS jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP).

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej' - caesar


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej

Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii

Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz

Opiekun pracy: dr Ewa Poboży

Ignacy Rzygaliński

Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej

Wprowadzenie

ABTS jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP)

β-NADH jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP)

GOx

GOx

Przedmiotem pracy było opracowanie metody derywatyzacji enzymatycznej w wysokosprawnej elektroforezie kapilarnej z detekcją spektrofotometryczną w celu ilościowego oznaczania substratów oksydaz. Reakcje derywatyzacji enzymatycznej przeprowadzano bezpośrednio w kapilarze, stanowiącej swoisty mikroreaktor zgodnie z opisaną wcześniej w literaturze procedurą EMMA (Electrophoretically Mediated Microanalysis). Stosowano różne sposoby prowadzenia reakcji - metodę ciągłego kontaktu reagentów, jak i metodę przenikających się stref. Wykorzystano układ bienzymatyczny oksydaza – peroksydaza z różnymi markerami detekcji oznaczanego związku.

Jako związek modelowy wybrano glukozę w celu jej ilościowego oznaczenia jako substratu reakcji utleniania w obecności oksydazy glukozowej (GOx). Zbadano trzy rodzaje układów pozwalających na uzyskanie sygnału spektrofotometrycznego, przy czym zawsze pierwszą reakcją zachodzącą w układzie była:

D-glukoza + O2 D-glukono-1,5-lakton + H2O2

Następna reakcja enzymatyczna miała na celu umożliwienie spektrofotometrycznej detekcji powstającego nadtlenku wodoru. W tym celu zastosowano drugi enzym, peroksydazę chrzanową (HRP), która katalizuje reakcje utleniania różnych związków za pomocą H2O2. Wykorzystano trzy różne substraty peroksydazy chrzanowej: kwas 2,2’-azyno-bis(3-etyleno-tiazolino-6-sulfonowy) (ABTS); dinukleotyd nikotyno-amidoadeninowy w formie zredukowanej (NADH) oraz 1,2,3-trihydroksybenzen (pirogalol). W zależności od właściwości absorpcyjnych powstających produktów, detekcję prowadzono przy różnej długości fali. Sygnał uzyskiwany od powstającego produktu jest proporcjonalny do zawartości D-glukozy w próbce. W warunkach takich możliwe są oznaczenia glukozy w zakresie stężeń od 0,005 do 0,1 mmol/L.

D-Glukoza + O2 D-Glukono-1,5-lakton + H2O2

H2O2 + β-NADH H2O + β-NAD

D-Glukoza + O2 D-Glukono-1,5-lakton + H2O2

H2O2 + ABTS(red) H2O + ABTS(ox)

ABTS(ox) + β-NADH ABTS(red) + β-NAD

HRP

HRP

detekcja

l = 260 nm

Metoda ciągłego kontaktu reagentów

detekcja

l = 260 nm

β-NAD

Metoda ciągłego kontaktu reagentów

Metoda klasyczna strefa - strefa

Wstrzyknięcie:

GOx (75 U/ml)

HRP (488 U/ml)

ABTS(red) (1 mM)

BGE:

HEPES (30 mM, pH=7)

β-NADH (1mM)

GLUKOZA

Wstrzyknięcie:

GOx (75 U/ml)

HRP (488 U/ml)

ABTS(red) (1 mM)

BGE:

HEPES

(30 mM

pH=7)

Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy

β-NADH (1 mM)

GLUKOZA

β-NAD

Reakcja u wlotu kapilary

β-NAD

Optymalizacja czasu inkubacji

GOx

β-NAD

Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy

Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy

Zależność powierzchni piku uzyskiwanego sygnału od czasu inkubacji u wlotu kapilary

Przykładowe elektroferogramy dla różnych stężeń glukozy (czas inkubacji 3 min)

  • Trudności obserwowane np. brak liniowości uzyskiwanego sygnału wynikają z:

  • reakcji ubocznych utleniania ABTS(red) tlenem

  • reakcji ubocznych utleniania NADH w obecności HRP zarówno H2O2, jak i tlenem

Zależność powierzchni piku od stężenia glukozy (0,001-0,1 mM)

Metoda EMMA (Electrophoretically mediated microanalysis)

Pirogalol jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP)

Różne sposoby prowadzenia reakcji enzymatycznej w kapilarze:

Metoda ciągłego kontaktu (continous mode)

Zastosowanie β-NADH jako bezpośredniego substratu peroksydazy chrzanowej pozwoliło ograniczyć układ do dwóch reakcji.

Nie udało się wyeliminować problemów związanych z niepożądanymi reakcjami ubocznymi utleniania β-NADH również tlenem, a nie tylko powstającym w wyniku pierwszej reakcji nadtlenkiem wodoru.

GOx

D-Glukoza + O2 D-Glukono-1,5-lakton + H2O2

ENZ

HRP

Substrat znajduje się w BGE,

zaś enzym wstrzykiwany jest w postaci strefy

Substrat

w BGE

Substrat

w BGE

Część eksperymentalną pracy magisterskiej wykonano na przyrządzie do elektroforezy kapilarnej Beckman P/ACE MDQ z matrycowym detektorem diodowym UV-Vis.

detekcja

l = 304 nm

pirogalol

purpurogalina

Warunki rozdzielania

Kapilara niemodyfikowana : l= 50 / 60 cm; i.d.=75 µm. Napięcie: +30 kV. Temperatura: +35,7 °C. Wstrzykiwanie hydrodynamiczne.

Roztwory wzorcowe pirogalolu i purpurogaliny

Reakcja u wlotu kapilary

Metoda przenikających się stref (plug-plug mode)

Metoda klasyczna strefa–strefa

(classic plug–plug)

Reakcja u wlotu kapilary

(at-inlet reaction)

pirogalol

purpurogalina

enzymy

Wnioski

Pierwszy wsztrzykiwany jest reagent wolniejszy

3 min

304 nm

Podjęto próbę derywatyzacji enzymatycznej w elektroforetycznych oznaczeniach glukozy z zastosowaniem oksydazy glukozowej i 3 różnych substratów peroksydazy chrzanowej. Dla dwóch z nich - ABTS i ß-NADH - uzyskano sygnały umożliwiające ilościowe oznaczenie glukozy. Zastosowanie pirogalolu nie przyniosło oczekiwanych rezultatów. W przypadku wykorzystania ABTS jako substratu HRP konieczne jest przeprowadzenie dodatkowej reakcji. Zastosowanie ß-NADH jako substratu peroksydazy znacznie uprościło układ, pozwalając tym samym na uzyskanie lepszych wyników. Nie udało się jednak wyeliminować trudności związanych z ubocznymi reakcjami utleniania ß-NADH tlenem.

1 min

SUB

214 nm

ENZ

INKUBACJA

EOF

EOF

Elektroferogramy roztworu wzorcowego mieszaniny pirogalolu i purpurogaliny

Elektroferogramy zarejestrowane dla różnych czasów inkubacji u wlotu kapilary

BGE

BGE

BGE

BGE

-

-

+

+

Nie udało się uzyskać oczekiwanego sygnału od purpurogaliny.

Widoczne jest tylko zgrubienie mogące pochodzić od strefy powstającego produktu.

PROD

PROD


ad