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SEMINARIO # 1. Equipo 3. Integrantes: Marcia Beatriz Moya Fernández Alianna Machín Suárez

Universidad Agraria de La Habana ¨Fructuoso Rodríguez Pérez¨. CURSO: BIOQUIMICA VEGETAL AVANZADA. SEMINARIO # 1. Equipo 3. Integrantes: Marcia Beatriz Moya Fernández Alianna Machín Suárez Yunier Cabrera Vázquez La Habana, 2009.

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SEMINARIO # 1. Equipo 3. Integrantes: Marcia Beatriz Moya Fernández Alianna Machín Suárez

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  1. Universidad Agraria de La Habana ¨Fructuoso Rodríguez Pérez¨ CURSO: BIOQUIMICA VEGETAL AVANZADA SEMINARIO # 1. Equipo 3. Integrantes: Marcia Beatriz Moya Fernández Alianna Machín Suárez Yunier Cabrera Vázquez La Habana, 2009

  2. Título del trabajo presentado: ¨Alta afinidad de Potasio (K+) en plantas de Pimiento (Capsicum annum)¨ Autores: María de los Ángeles Martínez Cordero Vicente Martínez Francisco Rubio Departamento de Nutrición Vegetal, Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura-CSIC, Murcia, España Noviembre, 2004

  3. Objetivos esenciales que se persiguen • Deteminar la alta afinidad en la toma de Potasio en plantas de pimiento (Capsicum annum)¨ • Determinar la expresión de transportadores involucrados en la toma de Potasio en plantas de pimiento (Capsicum annum)¨

  4. Materiales y Métodos • Crecimiento de las Plantas Semillas var. California, prehidratadas en solución aereada con 0.5 mM Ca SO4 durante 72 h. 151 contenedores (2 d germinadas) fueron preparados con una solución de Hoagland , modificada (tratamientos), como se muestra en la tabla 1. Ambiente controlado: 16h luz/8h oscuridad y temperaturas de 250C/200C respectivamente Humedad relativa de 65% día y 80% noche Densidad fotónica de 550µmol.m-2.s-1 La solución nutritiva fue reemplazada a las 2, 3 y 4 semanas.

  5. Tabla 1. Tratamientos Realizados

  6. Para evaluar la depleción y concentración de K+ en tejido vegetal • Sin suministro de K+, solución (1.4 Ca (NO3)2, 0.1 Ca (H2PO4)2 • y 0.2 MgSO4 + los micronutrientes anteriormente expuestos • Con suministro de NH4: 1.4 NH4NO3, 0.2 MgSO4 , 0.7 CaCl2 y 0.1 Ca(H2PO4)2 • Las plantas Control se mantuvieron en su solución nutritiva inicial • Luego se enjuagaron las plantas en una solución fría, libre de K+y en un tiempo zero, transferidas a 250 ml en contenedores con una solución suplementada con: 50 µM de KCl y diferentes concentraciones de NH4Cl, CsCl y NaCl. • La concentración de K+ se determinó por Espectrofotrómetro de emisión atómica (Perkin – Elmer Boston MA) 5500 • Los datos obtenidos se ajustaron según la ecuación de Michaelis - Menten y se calcularon los valores Km y Vmax

  7. Al final del experimento se separaron las raíces de los brotes y se halló la masa seca (determinación de K+ por espectroscopía de absorción atómica)l • División de raíces NH4 K+ Sin K+ Luego de 3 días se realizaron evaluaciones a las raíces y brotes : masa fresca y seca más los análisis químicos anteriormente dichos

  8. Aislamiento de cDNA y amplificación por PCR • Se sintetizó 2 µg de cDNA del total de RNA aislado de raíces de pimiento por el uso del primer oligo-dT y virus transcriptasa avian myeloblastosis (Amersham Pharmacia Biotec, Upsalla), siguiendo los protocolos standart en el sentido 5´-TTYAAYTAYTTYTGGGTIMGITGYGC- 3´y antisentido 5´- GCYTCRTTYTGIARDATIACRTCYTC -3´ primers designados para la conservación de las regiones: FNYFWVRCAK y EDVILQNEA presente en canales de K+ AKTI de varias especies. • El producto de PCR fue clonado y secuenciado en PCR vector 2.1 usando el kit TA cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA)

  9. Hibridaciones de ácidos nucleicos en gel - blot • Las hibridaciones RNA gel-blot se llevaron a cabo según las técnicas descritas por Sambrook et al., 1989. • El marcaje de las sondas, la hibridación y detección se conformaron con el uso de primer DIG y detección de sondas DNA, iniciadas con kit II (R oche Biochemicals, Summerville, NJ). • Para la hibridación RNA gel – blot, se separaron 30 µg del total de RNA de raíces, por técnicas de Electroforesis en 1.1% formaldehído en gel de agarosa y transferido a membrana de nylon.

  10. Resultados • Efecto de escasez de K+ del medio sobre la alta afinidad en el transporte de K+ en plantas de pimiento.

  11. Inducción localizada de la alta afinidad por la toma de K+

  12. Concentraciones de K+ en tejido de plantas en relación a la alta afinidad de K+ tomado 1.4mM 0.7mM 0.1mM Mostraron similar capacidad de depleción. Su efecto se hizo mayor con el incremento de los días (1µM en 120 min) Limitada capacidad de depleción día 0. en día 1 mayor tasa de depleción que las concentraciones anteriores (1µM antes de 120 min)

  13. Efectos del NH4+, Cs+, Na+ sobre la alta afinidad de K+

  14. Efecto del NH4+ en la solución nutritiva sobre la alta afinidad en la toma de K+

  15. Determinación de la expresión de Ca HAKI y Ca AKTI

  16. MUCHAS GRACIAS

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