FARMACOCINETICA

1. FARMACOCINETICA • La farmacocinetica descrive i processi di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione dei farmaci (ADME). • L’assorbimento è il processo tramite cui il farmaco penetra nell’organismo (sangue) dal sito di esposizione. • La distribuzione è il processo di passaggio dal sangue ai vari organi e tessuti.

2. Il metabolismo di un farmaco (di uno xenobiotico) è l’insieme delle trasformazioni chimiche che la molecola subisce all’interno dell’organismo, principalmente ad opera di enzimi. • La maggior parte dei farmaci, ma non tutti, viene metabolizzata.

3. Esempi di metabolismo: 1. acido acetilsalicilico

4. Esempi di metabolismo: 2. flunitrazepam

5. I derivati metabolizzati del farmaco (metaboliti) sono molecole con caratteristiche chimiche e farmaco-tossicologiche diverse dal composto di partenza. • In genere, i metaboliti sono privi di attività farmacologica. Il metabolismo è quindi una modalità di ‘eliminazione’ del farmaco (eliminazione epatica). • Diversi farmaci, tuttavia, hanno metaboliti ‘attivi’, dotati cioè di attività farmacologica simile a quella del farmaco ‘madre’.

6. Esempio di metabolismo con formazione di metaboliti attivi attivo inattivo

7. ATTIVAZIONE METABOLICA. DETOSSIFICAZIONE • Alcuni farmaci sono in realtà ’pro-farmaci’; sono cioè farmacologicamente inattivi ma vengono trasformati in composti attivi dal metabolismo. • In alcuni casi, i metaboliti dei farmaci sono tossici. • I metaboliti tossici possono essere ulteriormente metabolizzati, con formazione di composti non tossici (detossificazione)

8. Sulindac, un pro-farmaco Metabolita attivo

9. Metabolita tossico detossificazione

10. Il metabolismo degli xenobiotici è estremamente importante in Tossicologia, poiché può avere sia un effetto protettivo (eliminazione e/o detossificazione dello xenobiotico) sia un effetto dannoso (formazione di metaboliti tossici).

11. Metabolismo ed escrezione Il metabolismo ha una ‘logica’: trasformare la molecola in modo che possa essere facilmente escreta per via renale o biliare. Dato che le molecole idrofile sono eliminate più rapidamente di quelle lipofile, il metabolismo consiste principalmente nella trasformazione di molecole lipofile in molecole idrofile.

12. Fase I e Fase II del metabolismo • Le trasformazioni subite da uno xenobiotico da parte degli enzimi metabolizzanti sono suddivise in reazioni di fase I e reazioni di fase II. • Le reazioni di fase I portano in genere all’introduzione nella molecola di gruppi funzionali come -OH, -NH2, -COOH (reazioni di funzionalizzazione). • Nelle reazioni fase II, molecole endogene fortemente polari (es. acido glucuronico) vengono legate ai gruppi funzionali inseriti durante la fase I (reazioni di coniugazione). • Se uno xenobiotico ha già gruppi funzionali in grado di coniugare i substrati delle reazioni di fase II, viene metabolizzato direttamente dagli enzimi di fase II.

14. Le sostanze lipofile sono escrete più lentamente di quelle idrofile perché: • sono più facilmente riassorbite nel tubulo renale (o nell’intestino in caso di eliminazione biliare); • si accumulano nel tessuto adiposo

15. Durante il processo di formazione delle urine, si ha riassorbimento di acqua  aumento della concentrazione dei soluti nell’urina  gradiente di concentrazione urina-plasma  riassorbimento. Le sostanze lipofile sono riassorbite più facilmente perché attraversano meglio lo strato cellulare dell’epitelio tubulare.

16. E’ stato calcolato che il tempo di dimezzamento (emivita) dell’esobarbitale, che è pari a 5-6 ore, sarebbe, in assenza di trasformazione metabolica, di 2-5 mesi.

17. Variabilità della capacità metabolica • In natura, gli xenobiotici con cui vengono in contatto gli organismi animali sono di origine vegetale. • La capacità di diverse specie animali di metabolizzare gli xenobiotici dipende dalla selezione operata dall’esposizione agli xenobiotici vegetali. • Ad es., insetti che si cibano di molte piante diverse possono metabolizzare una varietà di xenobiotici maggiore degli insetti che si alimentano di poche o una sola specie vegetale.

18. Specie diverse di mammiferi possono avere differenze quali-quantitative della capacità metabolizzante  importanti per l’estrapolazione all’uomo di dati animali. • A livello individuale, la capacità metabolizzante è determinata, oltre che da fattori genetici, anche da fattori ambientali; la quantità di enzima presente può essere infatti aumentata da alcune sostanze (induzione enzimatica).

19. La velocità di metabolismo è il fattore più importante nel determinare la variabilità farmacocinetica interindividuale. • Gli altri processi influenzanti la farmacocinetica (assorbimento, legame con le proteine plasmatiche, distribuzione, escrezione renale) sono pressoché costanti da individuo a individuo; si hanno variazioni di questi processi solo in condizioni patologiche (in particolare, insufficienza renale). • Le interazioni tra farmaci più rilevanti sono dovute ad interazione a livello del metabolismo (induzione, inibizione, competizione).

20. Eliminazione pre-sistemica. Metabolismo di primo passaggio • Il metabolismo ha luogo principalmente nel fegato. • Alcuni farmaci raggiungono il fegato, tramite la vena porta, subito dopo essere stati assorbiti (nella parte superiore dell'intestino) e vengono estesamente metabolizzati prima di raggiungere la circolazione sistemica. Questo fenomeno, noto come metabolismo di primo passaggio, fa sì che il farmaco venga inattivato prima di raggiungere la circolazione sistemica e gli organi bersaglio: eliminazione pre-sistemica. L'eliminazione pre-sistemica può essere dovuta anche al metabolismo a livello della mucosa intestinale.

21. Conseguenze dell’eliminazione pre-sistemica • E’ necessaria una dose orale più elevata per ottenere lo stesso effetto (rispetto ad altre vie di somministrazione). In alcuni casi (nitriti) il metabolismo è così esteso che la somministrazione orale non ha effetto.

22. Esempi di farmaci con eliminazione pre-sistemica: • aspirina • clorpromazina • morfina • propranololo • verapamil • ciclosporina

23. Caratteristiche degli enzimi metabolizzanti • Gli enzimi metabolizzanti sono in genere poco specifici, metabolizzano cioè molti substrati diversi (ma con un dominio strutturale comune). • Alcuni enzimi sono deputati solo al metabolismo degli xenobiotici, altri sono coinvolti anche nella sintesi o degradazione di composti endogeni. • L’organo più ricco di enzimi metabolizzanti è il fegato. • Altri organi o tessuti con significativa capacità metabolica sono i polmoni, i reni, il sangue. • Alcuni tessuti hanno un’elevata concentrazione di enzimi metabolizzanti (mucosa nasale, cristallino), ma il loro contributo al metabolismo sistemico è pressoché nullo dato il loro piccolo volume.

24. La localizzazione degli enzimi è importante nel determinare l’organo colpito nel caso di formazione di metaboliti tossici. Molti metaboliti tossici sono infatti altamente reattivi e colpiscono quindi solo le cellule dell’organo in cui si formano. Ad es., molti composti sono epatotossici perché i metaboliti reattivi si formano nel fegato. • Inoltre, la tossicità è spesso limitata, all’interno dell’organo, alle cellule che possiedono l’enzima che porta alla formazione del metabolita tossico. Ad es., il paracetamolo e CCl4 causano necrosi centrolobulare perché le cellule della regione centrolobulare sono ricche di citocromo P450.

25. Localizzazione intracellulare degli enzimi • Un determinato enzima ha in genere un’unica localizzazione intracellulare. • Nel fegato gli enzimi sono localizzati principalmente nel reticolo endoplasmatico (enzimi microsomiali) e nel citosol. Un numero minore di enzimi è localizzato nei mitocondri, nei lisosomi, nel nucleo.

26. Reazioni di fase I • Sono le reazioni di idrolisi, riduzione, ossidazione. • Portano in genere all’introduzione o smascheramento di un gruppo nucleofilo (-OH, -NH2, -SH, -COOH). • Ciò causa solo un modesto aumento dell’idrofilia. Tuttavia, il gruppo funzionale nucleofilo fornisce un punto di attacco per le reazioni di fase II. • Le reazioni di fase I determinano in genere perdita dell’attività farmaco-tossicologica (modificazione della struttura chimica e della capacità di interagire con il recettore). In alcuni casi, tuttavia, i prodotti delle reazioni di fase I sono biologicamente attivi. I pro-farmaci sono attivati dalle reazioni di fase I. • Nelle reazioni di fase I, soprattutto le reazioni di ossidazione, si possono formare metaboliti tossici.

27. Enzimi di fase I - Ossidazioni • Citocromo P450 (CYP 450). E’ l’enzima più importante di fase I perché metabolizza un gran numero di xenobiotici  principale responsabile dell’inattivazione di molti farmaci e tossici diretti. • Coinvolto anche nella biosintesi o degradazione di molti composti endogeni (ormoni steroidei, vitamine liposolubili, acidi grassi ecc.) • Presente in tutti i tessuti. I livelli più alti sono nel fegato, a livello del reticolo endoplasmatico (frazione microsomiale)

28. Reazione generale: RH (substrato) + O2 + NADPH + H+ ROH + H2O + NADP+ • E’ una reazione di monoossigenazione in cui un atomo di ossigeno è incorporato nel substrato; l’altro atomo di O è ridotto ad H2O, con l’apporto degli equivalenti riducenti (elettroni) provenienti da NADPH. • Il prodotto ROH può subire riarrangiamenti  molti prodotti finali, diversi da alcol e fenoli.

29. CYP450 lega direttamente il substrato e O2. • I 2 elettroni provenienti da NADPH arrivano al complesso CYP450-substrato tramite una flavoproteina, la NADPH-citocromo P450 reduttasi.

30. amino ossidasi Tipi di reazione catalizzate dal CYP450: Idrossilazione alifatica e aromatica De-alchilazione di un eteroatomo Ossigenazione di un eteroatomo Trasferimento di un gruppo ossidativo. Riduzione

31. Epossidazione catalizzata da CYP450

32. Epossido idrolasi. Catalizza l’addizione di H2O agli epossidi formati (dal citocromo P450) nelle reazioni di ossidazione di alcheni e composti arilici. • Dato che questi epossidi sono quasi tutti altamente reattivi e tossici (cancerogeni), le epossido idrolasi sono enzimi detossificanti molto importante. • Sono ampiamente distribuiti nell’organismo; all’interno di alcuni tessuti, la loro distribuzione è parallela a quelle del citocromo P450  rapida detossificazione degli epossidi. • Alcuni epossidi non possono essere metabolizati dall’epossido idrolasi per ragioni steriche (bay region) e sono quindi particolarmente tossici (es., benzopirene-9,10-epossido).

33. L’epossido idrolasi è un enzima inducibile. La sua induzione è sempre associata a quella del citocromo P450. • Può essere inibito da alcuni epossidi e da alcuni farmaci  aumento della tossicità di composti metabolizzati ad epossidi.

34. Nell’uomo, esistono almeno 18 isoenzimi CYP450, che differiscono, parzialmente, per specificità, induttori, inibitori.

35. Ciascun isoenzima è caratterizzato dai substrati metabolizzati, dagli induttori ed inibitori. • Tuttavia, data la scarsa specificità delle varie isoforme, spesso 2 o più isoforme partecipino al metabolismo di un singolo xenobiotico. • Le varie isoforme possono catalizzare reazioni diverse sullo stesso substrato. • In molti casi predomina il metabolismo operato da un’isoforma. Il contributo delle varie isoforme dipende dai valori di Km e Vmax.

36. L’evoluzione degli isozimi CYP450 riflette l’esposizione ad un numero sempre maggiore di xenobiotici potenzialmente tossici, sintetizzati dai vegetali a scopo difensivo.

37. Variabilità degli enzimi metabolizzanti • Fattori genetici (variabilità interindividuale) • Se il metabolismo di un farmaco è regolato principalmente da un solo gene (un solo enzima o isoenzima), si possono avere tre casi generali: • 1. Il gene è presente in una sola forma, espressa in modo simile in tutti gli individui; • 2. Il gene è presente, nella popolazione, in due o più forme (alleli), i cui prodotti hanno attività enzimatica nettamente diversa; • 3.  Il gene è presente in una sola forma ma mutazioni dei geni regolatori causano una marcata riduzione dell’espressione genica.

38. Nel caso 1), la variabilità è determinata da fattori non genetici e la distribuzione della capacità metabolizzante nella popolazione sarà normale (gaussiana). • Nei casi 2) e 3) si osserva una distribuzione non normale (bimodale); sono presenti due (o più) popolazioni. • Sono quindi presenti almeno due fenotipi. In questo caso si ha polimorfismo genetico. Vi saranno quindi individui buoni metabolizzatori e individui cattivi metabolizzatori. In alcuni casi vi ulteriori fenotipi (ad es., metabolizzatori ultrarapidi)

39. Diversi isoenzimi CYP450 (ad es., CYP2D6) presentano polimorfismo genetico. • Anche altri enzimi metabolizzanti che presentano polimorfismo; ad es.: N-acetiltransferasi, glutatione-S-transferasi

40. CONSEGUENZE DEL POLIMORFISMO • I cattivi metabolizzatori eliminano il farmaco più lentamente e corrono quindi il rischio di sviluppare effetti avversi con dosi ‘ordinarie’ di farmaco. • D’altra parte, in soggetti con capacità metabolizzante molto rapida, dosi ordinarie possono determinare concentrazioni plasmatiche subterapeutiche e quindi un effetto clinico inadeguato. • L’influenza del polimorfismo di un enzima dipende dall’importanza della reazione catalizzata dall’enzima sull’eliminazione del farmaco.

41. Reazioni di fase II • Le reazioni di coniugazione (fase II), oltre ad aumentare l’idrofilia, prevengono l’ossidazione di diversi composti (fenoli, idrochinoni ecc.) ad elettrofili (es. CYP450 e altri enzimi) o radicali liberi (es. perossidasi).

42. Reazioni coniugative di fase II: • glucuronidazione • solfatazione • acetilazione • metilazione • coniugazione con glutatione (formazione di acidi mercapturici) • coniugazione con aminoacidi (glicina, taurina, acido glutammico) L’acetilazione e la metilazione portano ad una diminuzione dell’idrofilia ma possono proteggere dalla formazione di metaboliti reattivi

43. Coniugazione con glutatione • Un ampio spettro di substrati da’ reazioni di coniugazione con il glutatione, con meccanismi diversi: • Elettrofili (carboni fenilici e allilici): R-X + GS- R-S-G (tioetere) + X- X = (Cl, NO2, SO4, PO4) • GS- può anche addizionarsi a composti insaturi (alcheni, chetoni) • La coniugazione con GSH può detossificare molti composti elettrofili formatisi in fase I (epossidi, chinoni, chinoneimmine ecc.) • GS- può anche dare reazioni di sostituzione con eteroatomi (O, N, S); es., nitroglicerina

44. Le reazioni possono avvenire spontaneamente (elevata concentrazione cellulare di GSH) oppure essere catalizzate (maggiore velocità) dalla Glutatione-S-transferasi (GST). • La GST è un enzima ampiamente diffuso (fegato, reni, intestino, polmoni), molto abbondante nelle cellule (fino al 10% delle proteine totali). • Esistono 4 classi solubili e 2 microsomiali di GST; almeno alcune di queste sono inducibili

45. Molto importante nella detossificazione di metaboliti reattivi formatisi nelle reazioni di fase I e II. • La resistenza a xenobiotici tossici è spesso associata a sovraespressione della GST: • insetti resistenti a DDT • piante resistenti ad atrazina • cellule tumorali resistenti a chemioterapici

46. Differenze interspecie nell’attività GST  differenze interspecie nella tossicità Es.: aflatossina B1 cancerogena nell’uomo e nel ratto ma non nel topo, che ha alti livelli di una forma di GST. • Differenze interindividuali. Sono stati individuati polimorfismi genetici per due delle forme di GST umana (GST Mu1 e GST Tau1). Nei caucasici, circa metà della popolazione non esprime GST Mu1. Questi individui hanno un rischio più elevato di cancro colo-rettale e potrebbero essere più sensibili al tumore polmonare indotto dal fumo.

47. Induzione enzimatica • Numerosi agenti (farmaci, xenobiotici di sintesi e naturali, alimenti) possono indurre l’aumento della sintesi degli enzimi metabolizzanti, sia di fase I che di fase II. • Gli induttori possono essere suddivisi in classi, in dipendenza del pattern di induzione. • Alcune classi inducono un aumento della sintesi di numerosi enzimi metabolici. Altre classi sono induttori più selettivi; in genere, comunque, un induttore stimola la sintesi di più di un enzima metabolizzante.

48. Induttori ‘ad ampio spettro’ come il fenobarbital determinano un’ipertrofia epatica e proliferazione del reticolo endoplasmatico  aumento generalizzato della sintesi proteica nel fegato (regione centro-lobulare)  aumento di numerosi enzimi metabolizzanti. • Idrocarburi policiclici aromatici (IPA): inducono l’aumento della sintesi di alcuni isozimi CYP450 (soprattutto CYP1A1), con elevata capacità catalitica verso gli induttori, e, in misura minore, di altri enzimi (epossido idrolasi, UDP-glucurunosiltransferasi, glutatione-S-transferasi). • Altri induttori importanti sono: pesticidi alogenati (DDT, esaclorobenzene ecc.); policlorobifenili (PCB) e polibromobifenili (PBB); diossine clorurate (in particolare TCDD); steroidi.

49. E’ stata proposta la classificazione degli induttori in 2 classi, in dipendenza degli enzimi indotti e del meccanismo dell’induzione: • Induttori bifunzionali (TCDD, IPA e altri): inducono sia enzimi di fase I che enzimi di fase II; • Induttori monofunzionali (difenoli, tiocarbammati, isotiocianati ed altri): inducono prevalentemente enzimi di fase II (glutatione-S-transferasi, UDP-glucuronosiltransferasi) e la DT diaforasi (o NADPH-chinone reduttasi, che viene assimilata agli enzimi di fase II per il suo effetto detossificante).

50. Meccanismi dell’induzione enzimatica • Induzione mediata darecettori intracellulari, denominati tipo Ah (Aromatic Hydrocarbon); questo recettore è un fattore di trascrizione capace di legare il DNA in una regione denominata XRE (Xenobiotic Responsive Element), che contiene i geni che codificano per diversi enzimi metabolizzanti. Il legame dell’induttore con il recettore Ah causa la sua dissociazione dalle HSPs e la traslocazione nel nucleo (mediata da una proteina chiamata ARNT, Ah Receptor Nuclear Translocation); il complesso induttore-Ah-ARNT si lega alla XRE  modulazione della sintesi proteica. • Gli induttori bifunzionali utilizzano questo meccanismo mediato dal recettore Ah