Klt densitometer
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 66

KLT DENSITOMETER PowerPoint PPT Presentation


  • 309 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

KLT DENSITOMETER. ny Guntarti FARMASI 20 13. Kromatografi kertas. Kromatografi lapis tipis. KLT DENSITOMETER. Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT

Download Presentation

KLT DENSITOMETER

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Klt densitometer

KLT DENSITOMETER

ny Guntarti

FARMASI

2013


Kromatografi kertas

Kromatografi kertas


Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis


Klt densitometer1

KLT DENSITOMETER

  • Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT

  • Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm.

  • Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)


Klt densitometer

Teknik penggunaannya :

- Pengukuran sinar yang diserapdan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),

- Sinar yang diserap dan dipantulkan

- Atau sinar yang dipendarkan.

Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer.

5


Klt densitometer

Pada era perkembangan teknik kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph Scanner" yang lebih populer dengan nama densitometer makin banyak dipakai .

6


Klt densitometer

lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan

noda pada KLTsecara :

  • Absorpsi

  • Transmisi

  • Pantulan (refleksi) pendar fluor

  • Pemadaman pendar fluor

7


Sumber radiasi

Sumber Radiasi

  • Padaumumnyaspektrofotodensitometermemberikanrentanggelombangpenentuan 200-630 nm.

  • Lampu D2 (Deuterium) dipakaiuntukpengukuranpadadaerah ultra violet danlamputungsteinpengukuranpadadaerahsinartampak.

  • Untukpenentuanpendarfluordanpemadamanpendar fluor dipakailampubusur Hg bertekanantinggi.

  • Padadensitometrijugadilakukanpenentuantransmisiatauabsorpsidanretleksipadapanjanggelombangmaksimal.


Klt densitometer

  • Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal.

  • Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi

  • Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.


Klt densitometer

  • Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.

  • S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda (kromatogram) KLT.

10


Lanjutan

Lanjutan

  • Penentuankadaranalit yang dikorelasikandenganarea nodapada KLTakanlebihterjaminkesahihannyadibandingmetode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi)atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area nodakromatogramdiukurpadaposisilurusatau "Zig-zag" menyeluruh.

  • Korelasikadaranalitpadanodakromatogram yang dirajahterhadap area tidakmenunjukkangarislurus, akantetapimerupakangarislengkungmendekati

    parabola

11


Kurva hubungan serapan dan kadar

Kurva hubungan serapan dan kadar

  • Persamaan Kubelka-Munk

  • Korelasikadaranalit yang dirajahterhadap area kromatogramtidakmerupakangarislurus.

  • Bila REM (RadiasiElektroMagnetik) denganintensitassemula (I0)jatuhpadapermukaanlapisantipis yang tidakhomogendenganarahrambatantegaklurus, makasebagiandari REM tersebutakan:

  • direfleksikan(Is)

  • diserapolehanalitlapisantipis (I)

  • diteruskan (It).

  • I=10+ Is+ It

12


Klt densitometer

  • Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai :

  • Is= I. E

  • Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :

  • I0 =I-Is

  • I0=I-I.E=(I-E)I

  • Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri.

  • It =I0. e-KX

13


Klt densitometer

E = koefisienpermukaan lapis tipis

Hk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt

x= tebal medium lapis tipis

k= koefisien absorbsi

e-kt= berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “ Optical density”

Parameter S (koef. Penghamburan)

It =I0. e-KX


Klt densitometer

  • Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter :

  • K (koefisien absorbsi)

  • S (koefisien penghamburan). 

  • Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam.

15


Parameter s koef penghamburan

-

dl

= + (S + K ) I + Sj

dx

dl

= - (S + K ) I + Sj

+

dx

Parameter S (koef. Penghamburan)

  • Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis

  • Sx = tiap pelat berbeda harganya

    = 0 -10


Klt densitometer

I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak

lurus menuju permukaan lapis tipis

j = radiasi elektromagnetik yang arahnya

meninggalkan permukaan lapis tipis

S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan

tebal lapis tipis

K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal

lapis tipis


Pernyataan kubelkan munk

( I – R )2

C

= E x

2R

S

Pernyataan Kubelkan – Munk :

E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit

pada pelat KLT

C = kadar analit

R = cahaya terpantul pada permukaan lempang

Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan sebagai kurva parabola :

A2 = f ( C )

log A = f ( log C )


Bagan alat densitometer

Bagan Alat densitometer

SumberSinar

  • Gambar

Photo multiflier

Untukrefleksi

Sinarpolikromatis

Sinarpantulan

Sinar Mono

kromator

Monokromator

Densitometer

Single beam

Densitometer

Double beam

Photomultiflier

Untuksinar yang diteruskan

19


Klt densitometer

S

S

Mk

Mk

PM

PS

PM

PM

I

I

I

I

Lempeng

Lempeng

PM

T

( a )

( b )

Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)


Klt densitometer

  • Photomultifliertersebutdapatmemperbesartenagabedapotensiallistriksehinggamampumenggerakanintegrator.

  • Integratordengansistemmikrokomputersecaralangsungdapat menghitungluaspuncakatautinggipuncaksecaraotomatik.Selain itumencatatnomerurut, kedudukanpuncakpada ordinal Y atauwakturetensinya.

  • Letak sumbu Y danX darilempengakan mempengaruhi hasil yang diperoleh.

  • Kalau Y disesuaikandenganarahgerakeluendansumbukX tegakluruspadanyaataumerupakanderetanpenotolansampelpadalempeng. Dengancaraitumerekaakanmendekatikepastian.

22


Cara kerja pelacakan bercak densitometer

Cara kerja pelacakan bercak Densitometer

7

  • Gambar

3

2

0,245

5b

145

5a

1

4

6

Gambar Densitometer Model CS-930 Shimadzu, 1= pendukung

Lempeng. 2=Sistemoptik (sinar). 3=Sumbersinar (UV/Visibel)

4= Tombolpenggeraklempeng, 5a= Angkakedudukanlempeng (mm) 5b= angkaserapan 6= Key Board, 7= kromatogram

23


Cara kerja densitometer

Cara Kerja Densitometer

Lempeng yang telahdigunakanuntukpemisahan. diujidulukedudukansetiapbercakpadasumbu(X,Y). agar sinardapattepatmengenaipusatbercak.

  • Setelahtomboldihidupkanlempengditempatkanpadasatugarisderetan Y,bercakdiatur, dangerakanlempengdiatursesuaikedudukanbercak, menggunakanmikrokomputer.

  • Panjanggelombangdiprogram agar terjadiserapansecaramaksimum, bilabelumdiketahuidilakukanscanning lebihdulu.

24


Klt densitometer

  • Scanningpengujiankuantitatifada 2 cara:

  • A. Cara memanjang

  • Sinardilewatkanpadatengahbercak, sehinggabercakhanyadideteksisepanjanggaristengahnyasepanjangsumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnyabaikbilabercakberbentukbulatsemetris.

  • B. Sistemzig-zag

  • Sisteminidiprogramberjalanmemanjangsumbu Y tetapiberbelok -beloksampaigaristepibercakpadagaris X, sehinggabergerakdari Y1-Y2, dan X1-X2.

25


Klt densitometer

y1

y2

b

a

  • Pelacakanbercak,

  • Gambar. Cara pelacakanbercakdengan TLC Scanner

  • (a) Model zig-zag. ( b). model lurus

    Kelebihan penggunaanmetodezig-zaglebihmeratapengukurannya, apalagi delta Y menggunakanjarakterkecil.

  • Kelemahannyawaktu lebih lama, tetapiketelitianpengukuranlebihterjamindibandingpenggunaanmetodepengamatanlurus.

x1

x2

26


Klt densitometer

  • Keterangan tambahan

  • Besarnyabercak, dari X1sampai X2 lebihbesardarigaristengahbercak agar semuabercakteruji.

  • Delta Y, selisihgariskesatudankeduamakinkecilmakin rata pengukurannya, antara 0,001 sampai 0,1 mm,kode yang diberikanangka 1 sampaidengan 3.

  • Simbul Y tergantungdalammeletakkanlempengterhadaparahscanning, (lihatpanah) sesuaigaris Y, dangaristegaklurus Y adalahgaris X.

27


Klt densitometer

  • Perhitunganluasatautinggipuncaksudahdilakukansecaraotomatisolehalat, satuanluas area (mikro volt) yang terteramerupakanbesaranpuncak. Kadang-kadangprosentase yang tertulishanyamerupakankadarrelatifdaripuncak yang muncul (tergambar).

  • Dalampengamatanlurusbilabercaknyatidaksemitrisakankurangtelitisebabkonsentrasiterbesartidakselaludilewatisinarpelacakbercak.

  • Penotolandengan bercakkecilkemungkinanmolekulsenyawauntukmengumpulditengahlebihbanyak.

28


Analisis kualitatif

Analisis Kualitatif

  • Analisis kualitatifhanyadapatdibandingkanwakturetensinya, ataudilakukanpenyariandaribercaksetelahdielusi, dankemudiandiujisecaraspektroskopi.

  • Tetapiadanya densitometer, spektrogramnyadapatdiuji.

Sinar mono

kromatis

Propilspektrogram

IntensitasSerapan

`

Bercak

Panjanggelombang (nm)

29


Cara menyari ekstrasi

Cara Menyari/ekstrasi

Bercakpadalempeng yang dilihatdibawahsinar UV diberitanda (lingkari) denganujungpensil, kemudiandiambillapisantipisbersamabercaknya.

Lapisan yang diambil dimasukkan kedalamgelaspiala, ditambahpelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dansetelahlarut,disaring.

Kedalamlabutakar, dancairandijadikan volume sampaitepattanda ( 10,0 ml). Larutansiapdiujidenganalatspektrofotometer.


Klt densitometer

  • Larutan yang didapatdiujidenganspektrofotometer padapanjanggelombangserapanmaksimumnya.

  • Karenapengenceranmerupakanfaktorpentinguntukperhitungankadarsenyawa yang diujisecarakuantitatifsegalacaranya,

Diencerkan

Disaring

Dilarutkan


Gambar chamber yang banyak digunakan

Gambar Chamber yang banyak digunakan

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC)

Chamber

lempeng

Tutup dapat diganti, dengan tutup yang

dapat dihubungkan pompa hampa, dapat

digunakan untuk menyimpan lempeng yang

telah dikeringkan


Klt densitometer

*Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring.

*Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap.

*Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak jenuh


Klt densitometer

Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif

Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)

Lempeng


Alat hptlc high performance thin layer chromatography

ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

1

2

3

4

1. Pelacak bercak 2. Monitor

3. PC 4. Key Board


Klt densitometer

Pipakapiler

Totolan

Totolan manual.

Penotolan


Klt densitometer

Chamber

Tempatelusi

Lempeng Silica gel

Bercak

Cairanelusi


Jalannya sinar otik

JALANNYA SINAR (OTIK)


Klt densitometer

Aplikator, penotol sampel otomatik


Hasil scanning satu bercak

HASIL SCANNING SATU BERCAK


Scanning senyawa yang berbeda

Scanning senyawa yang berbeda

Senyawa a1, a2, berbeda,

sehingga mempunyai serapan maksimum

pada lambda yang berbeda.

b

1

b

b

2

Digunakan metode:

  • Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya.

  • Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang dapat dimiliki oleh semua senyawa.

a

a

a

Demikian pula senyawa b1, b2, berbeda,

sehingga mempunyai serapan maksimum

pada lambda yang berbeda.

2

1


Hasil r ekaman

HasilRekaman

Cara satu persatu

  • Hasil

a

a

2

1

b

b

2

1

Kurva

Kurva

a

a

1

2

Cara serentak

Kurva

a

a

+

2

1

Kurva

Kurva

b

b

1

2

Kurva

b

+

b

1

2


Klt densitometer

HASIL ELUSI

HASIL SCANNING SERENTAK

BERCAK BAKU

BERCAK SAMPEL

SEBELUM ELUSI


Klt densitometer

  • Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda


Klt densitometer

  • Scanning serentak beberap puncak/bercak


Menghitung waktu retensi

MENGHITUNG WAKTU RETENSI

z

Batas eluen

d

y

x

Rf = a/c (cm)

b/c (cm)

e

a

f

b

C

Yang ditampilkan

oleh rekaman

Arah scanning

Bila rekaman kekanan Rf =x/z atau y/z

Karena alat tak tau berapa jarak migrasi

eluen

Bila rekaman kebawah Rf =d/f atau e/f

Karena alat tak tau berapa jarak migrasi

eluen, dan tempat penotolan


Klt densitometer

  • Contoh 1

  • Analisisgolongantetrasiklin, denganfasediam :seluluse F, Fase gerak: larutan MgCl2 0,25 M. (Nornendy, 1993).

    Kromatogramtetrasiklindanturunannyadilihatdibawahsinar UV, 366 nm

  • IsotetrasiklinRf =0,02 (coklat),

  • AnhidroterasiklinRf=0,3(merah-ungu)

  • Terasiklin HClRf =0,73 (merahungu)

. . . . . . . . . . .

0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0

49


Klt densitometer

TETRASIKLIN

Tetrasiklin C22H24N2O8 sda

Klortetrasiklin C22H23N2O8Cl 7-Cl

Oksitetrasiklin C22H24N2O9 5-OH


Penjelasan tetrasiklin

Penjelasan Tetrasiklin

  • Turunantetrasiklindapatmembentukkhelatdenganlogambervalensi +2 sehinggatidakakanbaikbiladigunakansilika gel GF.

  • Tetrasiklindapatmembentukikatankompleksdengan Ca++sehinggatakdapatdielusisempurna.

  • Biladigunakanselulusasebagaifasediam, terdapat bataskelarutandalamselulusa, danterjadiikatanhidrogen.

  • Denganeluenlarutan MgCl2,tetrasiklin dapatmembentukikatankomplekslebihbaikdibanding yang lain.

51


Struktur kimia

Struktur kimia

H3C

N(CH3)2

N(CH3)2

N(CH3)2

H3C

OH

H3C

OH

OH

OH

  • Gambar

O

CONH2

OH

OH

OH

CONH2

OH

O

O

O

O

O

OH

OH

OH

O

OH

CONH2

O

IsoTetrasiklin

AnhidroTetrasiklin

Tetrasiklin

NH2

HO

SO3Na

CH3

HC

CH3

-N=N-

-N=N-

-N=N-

SO3Na

HO

Kuning AB

Kuning no.3

Pomceo

Tartrazin

CH3

SO3Na

NH2

-OH

Na O3S

-N=N-

SO3Na

-N=N-

Kuning OB (kuning no.4)

Oranye I

52


Klt densitometer

  • Contoh 2.

    Analisiszatwarnalipstik, fasediam :silika gel,

    fasegerak :campuran n-isopropiletilasetatdanamoniak 10% (65:75:60) ( Wulandkk, 1991)

    Kromatogramzatwarnalipstik

  • TartasinRf =0, 12 (merahmuda)

  • Kuning AB Rf= 0,48 (kuning)

  • Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau)

  • Oranye I C, Rf=0,88 (putih)

  • Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan)

. . . . . . . . . . .

0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0

53


Penjelasan zat warna

Penjelasan Zat Warna

  • Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazinponcou, oranye I, kuning AB, kuning OB (paling kuranglarutdalam air).

  • Fasegerakberupaamoniak 10%, makatartrazinkuranglarutdalamfasegerak, tetapimudahlarutdalampelarutorganik. Tartrazinsifat base lebihkuat, daripancousehingga paling lambatmigrasinyadalamsuasanabasa (amoniak 10%).

  • Bilazatwarnatidakdiscanner, tetapibercakdisarikemudiandiencerkanetanolsampai 5,0 ml. Larutan yang didapatdiujidenganspektrofotometerpadapanjanggelombangserapanmaksimumnya:

54


Analisis kuantitatif

AnalisisKuantitatif

  • Analisiskuantitatifdiperlukansenyawabakupembanding, dandibuatkurvaregresi linier.

  • Untukmengujitetrasiklin yang tidakmengalamidegradasidigunakancaraanalisisdengan KLT

  • Dibuatkurvabakuhubungankadar (mcg/ml) danluaspuncak (mV).

    Data Kadar Luaspuncak

  • 0,0 mcg 1,96 mV

  • 5 mcg 8,5468 mV

  • 10 mcg 13,6856 mV

  • 15 mcg 19,0454 mV

  • 20 mcg 23,9754 mV

  • 25 mcg 29,356 mV

  • 30 mcg  38,675 mV

Dari data ini dapat dibuat

kurva baku regresi linier

yang kemudian dapat

digunakan untuk menghitung

kadar sampel yang tak diketahui

tetapi terbaca luas areanya.


Kurva regresi linier normal

Kurva regresi linier normal

Y= 2.396 X + 1.097

56


Aplikasi garis regresi

Aplikasi Garis regresi

  • Persamaan kurva kromatogram yang didapat pada pengamatan tetrasiklin mempunyai persamaan regresi linier sebagai berikut:

  • Y = 0,513 X + 1,487, R- 0,9996 

  • Contoh menghitung:

  • Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV,

  • Maka harga X :

  • = (24,487-1,487): 0,513 = (23)70,513 =44,834 mcg/ ml


Klt densitometer

Untukanalisis kuantitatif zatwatnatidakdiscannertetapibercakdisarikemudiandiencerkanetanol, dandiencerkansampai 5,0 ml.

Carapenyarian, pemisahan dan pengenceranharusoptimal. Untukmembuatkurvabakudiperlukanlempeng yang besaruntukelusisenyawabaku yang berbedakadarnya.


Yang perlu diperhatikan dalam uji kuantitatif

Yang perlu Diperhatikan Dalam uji Kuantitatif

1. Pemisahan antara obat

2. Liniritas kadar yang dapat diuji

3. Ketelitian hasil

4. Ketepatan hasil.


Hasil penelitian rhodamin

Hasil penelitian Rhodamin

a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)


Klt densitometer

Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan 366 nm

Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm

a. Kerupuk ketela


Klt densitometer

b. Kerupuk bunga (tersanjung)

c. Kerupuk unyil


Klt densitometer

A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:

1. Standar Rhodamin B

2. Sampel kerupuk ketela


Klt densitometer

B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga

1. Standar Rhodamin B

2. Sampel kerupuk bunga


Klt densitometer

C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil

1. standar Rhodamin B

2. Sampel kerupuk unyil


Kesimpulan penggunaan hptlc

Kesimpulan penggunaan HPTLC

a. HPTLC dapatdigunakanuntukmemisahkandanmenganalisiscampuransenyawaantara 20 sampai 30 senyawa.

b. Biayapemeliharaan, operasinal, jauhlebihmurahdari HPLC.

c. Cara deteksinyabercak(senyawa) padalempenglebihbanyakpilihandari HPLC walaupundenganpereaksiwarna.

d. Pemisahan yang terjadipada HPTLC lebihdari 10 menit, sedangkan HPLC mungkin lima menitsudahselesai.

e. Ketilitiandanketepatanmendekati HPLC.


  • Login