دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج

1. دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج

3. پایان نامه های كارشناسي ارشد

4. گروه : علوم پايه

5. رشته تحصيلي : ميكروبيولوژي

6. جداسازي وکلونينگ ژن cagA هليکوباکتر پيلوري در اشرشياکلي

7. نام و نام خانوادگي دانشجو : کاوه اشتي بقايي ، شماره دانشجويي : 84357001028

8. به راهنمايي :جليل ونديوسفي • چكيده: • بيش از نيمي از مردم جهان با H. pylori آلوده هستند اما تنها بخش بسيار کوچکي ازآنها بيماري هايي همچون سرطان و يا زخم معده را بروز مي دهند که دليل مشخصي براي اين امر وجود ندارد.از مهمترين ژن هاي مرتبط با بيماري زايي اين باکتري ژن cagA مي باشد که توالي يابي اين ژن تنوع بالاي آن را در بين سويه هاي H.pylori جدا شده ازسايرنقاط جهان نشان مي دهد.همچنين وجود نواحي تکراري EPIYA نقش موثري را در بيماريزايي اين باکتري ايفا مي کنند. از اينرو جدا سازي و کلون کامل ژن cagA سويه هاي ايراني H. pylori و سکانس و تعيين توالي دقيق آن به منظور تفسير مکانيسم بيماري زايي اين باکتري در ايران ضروري است. پروتئين cagA پروتئيني با وزن مولکولي 120 تا 180 کيلودالتون است که خاصيت آنتي ژنيک دارد و با بيماريهاي مهمي همچون زخم معده همراه است. اين پروتئين بوسيله ژن cagA کد مي شود که شاخص مهم بيماريزايي در هليکوباکتر پيلوري محسوب مي شود. باکتريهيي که داراي ژن cagA هستند با بيماريهاي مهمتري از معده همچون گاستريتهاي شديد، زخم معده و سرطان معده در ارتباطند. در اين مطالعه پلاسميد نوترکيب کد کننده cagA ايجاد و به منظور شناسايي و تاييد آن عمل سکانس کردن انجام شد.براي انجام اين آزمايش بيوپسي گرفته شده از بيماران بوسيله روشهاي متداول برروي محيط Brain Heart Infusion Agar کشت داده شد سپس DNA آن بوسيله کيت QIA GEN و پروتکل موجود در آن تخليص گرديد. ژن cagA بوسيله Long PCR و به صورت کامل تکثير گرديد و پس از تخليص نمودن قطعه مورد نظر درون پلاسميد pET-21 کلون گرديد. سپس پلاسميد نوترکيب به درون باکتري E. coli XGold به روش cacl2 ترنسفورم شد. کلنيهاي مثبت حاصل از ترنسفورميشن بوسيله PCR و هضم آنزيمي مشخص گرديد. قطعه وارد شده بوسيله پرايمر مشخص و با دستگاه sequencing توالي يابي شد. به منظور تفسير تواليهاي بدست آمده از نرم افزارهاي seq man و Edit seq استفاده شد. • ژن cagA با طول تقريبي 3521 درجزاير پاتوژنيک موجود در هليکوباکترپيلوري بوسيله پرايمرهايي با دو سايت برش تکثير گرديد. محصول PCR و پلاسميد بوسيله دو آنزيم BamH I و Xho I مورد هضم قرار گرفتند. که در ادامه با وارد کردن پلاسميد pET-21-cagA به درون باکتري E. coli کلونينگ ژن مورد نظر انجام گرفت. نتايج سکانس ميان ژن cagA کلون شده و توالي ژن موجود در بانک اطلاعاتي همولوژي ميان آن دو را مشخص نمود.در اين مطالعه با طراحي دو پرايمر مناسب با قرار دادن دو سايت برش و با واکنش Long PCR و با محاسبه ميزان مناسبي از محصول PCR و پلاسميد کلونينگ ژن cagA حاصل از H. pylori با موفقيت انجام شد.