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Flowcytometry Analysis 123

Flowcytometry Analysis 123. Morphology. Flowcytometry. May 7, 2010. Flowcytometry step 1. Flow 上機前準備工作. PB/ 骨髓血 / 骨髓 / CSF/LNs… 一般 3cc (heparin 綠頭管 ) 須打洞者，約 5cc 準備 mononuclear cells < 方法一 > 加入 Ficoll 離心 < 方法二 > 加入 NH4Cl RBC lysis ( 無核 RBC), wash 染色

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Flowcytometry Analysis 123

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Presentation Transcript

  1. Flowcytometry Analysis 123 Morphology Flowcytometry May 7, 2010

  2. Flowcytometry step 1

  3. Flow 上機前準備工作 • PB/骨髓血/ 骨髓/CSF/LNs… • 一般3cc (heparin綠頭管) • 須打洞者，約5cc • 準備mononuclear cells • <方法一> 加入Ficoll離心 • <方法二> 加入NH4Cl RBC lysis(無核RBC), wash • 染色 • PE螢光強, FITC螢光弱 (所以想看什麼盡量用PE) • 福馬林固定 • 上機 (BD Canto-II可測8+2色螢光) • 一般收10,000 events • MRD收100,000 events

  4. 特別事項 • 需打洞打洞，染色，固定，約需5cc的血 • Tissue flow: • 花生大小，切片完盡速丟入N/S或RPMI • 須加入7AAD辨認細胞viability(染不上色為活細胞) • 細胞存活: • PB/BMblood可保存於室溫72小時 • Tissue可丟入N/S中，亦可丟入RPMI存活更久 • Sorting: • 目前借用中研院的sorter (Coulter) • Sorting後的細胞為活細胞，可做cytogenetic、FISH、PCR

  5. FITC GFP 90° Side Scatter (SSC) “Granularity” PE Cy3 PI APC PerCP PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 2-16° Forward Scatter (FSC) “Size” Flow原理—FSC, SSC

  6. 舉例:Myeloid panel Tube FITC PE PerCP # 1 (control) auto-fluorescence (不使用isotope) CD45 # 2 HLA-DR CD11b CD45 # 3 CD5 CD19 CD45 # 4 CD56 CD38 CD45 # 5 CD16 CD13 CD45 # 6 CD15 CD34 CD45 # 7 CD14 CD33 CD45 # 8 CD7 CD56 CD45 # 9 HLA-DR CD34 CD45

  7. Flow可能的陷阱 • 檢體處理: • Ficoll會損失大量neutrophil，無法準確評估mature myeloid cells • 可能會有dying cells (各種marker都變弱) • Lab: • 可能會有doublets (2 cells connected) • 可能會有auto-fluorescence過強 (通常呈一直線) • 可能會有bubbles (飄在頂端) • Analysis: • 可能會有over-compensation 或under-compensation • Plasma cells極端脆弱，評估%實在不準，僅供參考 • APL很難判讀 • Erythroid在分析上很困難 • Megakaryocytes無法分析

  8. 歷史的分歧

  9. Flowcytometry step 2

  10. 基本:FSC-SSC, SSC-CD45 R3 R2 • 記住位置 • 記住gating順序及意義 (R1, R2, R3, R4, R5) R1NEC R4 R5

  11. RBC/NRBC在哪裡?

  12. 評估myeloid maturation Neu • DR-11b 呈一直線 • CD16-CD13 呈鉤狀，且neutrophil應佔20%以下 Mye/Meta Promye

  13. Myeloid series I II III IV V CD15 103 CD11b DR CD33 102 Antigen Density CD45 101 CD13 CD34 CD10 CD16 CD117 Neutrophil Maturation

  14. 正常:跳躍式的phenotype表現 on/off, up/down, splicing D A B E F C Phenotypic changes occur together

  15. 異常:某些phenotype增加/減少 Each patient unique A d B F C Cell death/apoptosis

  16. T-lym Eosinophil NK Basophil

  17. 評估Blymphoid maturation • 記住Bcells位置—stage 1234 • 記住CD20-CD10呈ㄣ字形 T III, IV II I T I IV III II II III I IV

  18. B-lymphoid series I II III IV CD 10 3 10 CD 34 FMC 7 CD 45 Antigen Expression CD 19 2 10 CD 20 CD 23 CD 22 TdT CD 5 1 10 B lymphoid maturation

  19. 異常的flow形態 • Lineage infidelity • Lymphoid on myeloid • Myeloid on lymphoid • Maturational asynchrony • Immature antigens on mature cells • Mature antigens on immature cells • Antigeneic absence • Loss of marker that should be present • Quantational abnormality • Over-expression • Under-expression Wells DA, Benesch M, Loken MR et al, Blood, 2003, 102: 394-403

  20. 你需要背的幾點… • 通則 • FSC-SSC的最左側有cell debris、dying cells、erythroid，不要gate • Auto-fluorescence處無法判讀 (通常呈一直線) • 要常常注意FSC(size)，大細胞常常是target cells • 如果有多出異常marker，要注意是不是doublets • Marker+會比marker-更重要，也比較容易將來當MRD的重要工具 • 報告cell %時，不同tubes可能會略有出入，以最有意義的那一管來報結果 • 使用NH4Cl RBC lysis後的cell percentage約等同於NEC • 善用forward gating與backward gating，及其他gating strategy (選擇適當的G1, G5…)來幫助判斷是否grouping/homegenous • 想一想檢查MRD時: • 如果異常只出現在一管? 會是lab error? • 如果異常反覆出現在多管? 比較有信心

  21. 你需要背的幾點… • Myeloblast • 與lymphoblast位置不同，size也較大 • CD34、DR用來辨認immature cells，CD34先消失，DR後消失 (所以沒有CD34+/DR-cells) • Myeloblast需與basophil鑑別 (DR-/11b+) • Myeloblast如果有aberrant CD19+，常為M2 • Myeloid maturation • 依DR-11b與CD13-CD16的形狀來決定 • Promyelocyte多時 (如APL或maturation arrest)，fluorescence很強，正常情況下promyelocyte約占8%(>15%表示left shifting) • Neutrophil為CD15+，但此管的CD34+%比較不準 • CD16是GPI-anchor protein (for PNH)

  22. 你需要背的幾點… • Mono • DR+, CD14+是最重要marker，也會CD16+ • CD33+(強過myeloid) • CD16是GPI-anchor protein (for PNH) • Monocyte某一stage會帶有CD4+ • Eosinophil • Eosinophil cap是一大特徵 (SSC-CD45) • Eosinophil在FSC-SSC的最左方 • CD16-CD13的位置也很有特色 • Basophil • SSC-CD45位置與myeloblast接近, 但DR-/11b+ • CD16-CD13的位置也很有特色 • (RBC與basophil沒有CD38)

  23. 你需要背的幾點… • Lymphoblast • CD34+ 為stage 1，CD34-/DR+ 為stage 2 (1+2就是所謂hematogone，在regeneration時常常很旺盛) • TdT也是不成熟細胞的表徵 (出現在TB，極少在myeloid) • 以cCD79a來辨認B-lineage, cCD3來辨認T-lineage • BM裡沒有T-lymphoblast (所以任何BMimmature blasts with CD2/3/5/7...都是異常)，只有T-lymphocytes, NK cells • CD1a為thymic antigen，是不成熟T細胞的表徵 • 大部分的B-ALL是CD10+(Common ALL) • 大約一半的B-ALL，CD45表現為dim，甚至negative

  24. 你需要背的幾點… • B-lymphocytes • Light chain restriction大多用CD19+搭配κ或λ看，low grade較明顯，DLBCL常常較dim • DR+ • 正常人本來就有一小部分CD19+/CD5 dim的細胞 (所以可解釋CLL) • T-lymphocytes • DR-，但activating T or NK會DR+(所以DR+會出現在B及activating T orNK，DR-的aberrant T cells得優先考慮T-lymphoma) • CD45+，且比B強 • NKcells • cCD3+，但是CD3-，CD5-(與Tcell重要的不同) • CD2+，CD7+，CD16+，CD56+，11b+ • 位置也很特別，靠近myeloblast處 (SSC-CD45) • Activating T or NK會DR+

  25. 你需要背的幾點… • Plasma cells • 因為很脆弱，%一般不準，只能看有無 • CD38bright(通常在天花板)，CD138+ • Light chain restriction大多用CD38+或CD138+搭配κ或λ看 • Myeloma cells: CD45dim(所以落點特殊)，大多CD56+ • 如果CD25+，考慮HCL或ATLL • Erythroid • CD45-, CD38-, 幾乎全部的marker都陰性 (RBC與basophil沒有CD38) • 很難判讀, 因此flow無法確診M6，也很難與MDS區分 • 打洞 • 打洞後需要另外拉control組才能判讀 • Tissue flow • 活細胞為7AAD-，我們只判讀7AAD-的細胞

  26. Flowcytometry step 3

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