1 / 62

DNA 提取

DNA 提取. 一 . DNA 种类：. 真核生物 DNA 、细菌 DNA 、病毒 DNA 、质粒 DNA 细胞悬液 DNA 、组织 DNA. 双链环状、双链线性、单链环状 细胞核 DNA 、细胞器 DNA. 二 . 提取 DNA 总的原则：. 1. 保证核酸一级结构的完整性； 2. 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；. 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 4. 其他核酸分子，如 RNA ，也应尽量去除。. 三 . DNA 样品准备. 1. 生物组织：.

brandon-gray
Download Presentation

DNA 提取

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNA提取

  2. 一. DNA种类： • 真核生物DNA、细菌DNA、病毒DNA、质粒DNA • 细胞悬液DNA、组织DNA

  3. 双链环状、双链线性、单链环状 • 细胞核DNA、细胞器DNA

  4. 二. 提取DNA总的原则：

  5. 1. 保证核酸一级结构的完整性； • 2. 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

  6. 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； • 4. 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

  7. 三. DNA样品准备

  8. 1. 生物组织： • 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存－70℃或液氮

  9. 液氮冷冻敲碎研磨 • 组织匀浆法 • 液氮匀浆法

  10. 2. 培养细胞 • 悬浮生长细胞：1500g离心，4℃10分钟收集细胞 • 单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集

  11. 3、血液样品

  12. 血液抗凝易用柠檬酸抗凝液（ACD）： • 柠檬酸 0.48g • 柠檬酸钠 1.32g • 右旋葡萄糖 1.47g • 加H2O 至 100ml • 每6ml新鲜血液加1ml ACD液，0℃保存数天，-70℃长期贮存。

  13. 四. DNA提取

  14. 1. 酚抽提法： • 先用蛋白酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯仿抽提，最后乙醇沉淀。获DNA大小为100－150kb

  15. 2. 甲酰胺解聚法： • 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。可得DNA 200kb左右。

  16. 3. 玻璃棒缠绕法： • 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

  17. 4. 异丙醇沉淀法： • 基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。

  18. 5. 表面活性剂快速制备法： • 用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

  19. 6. 加热法快速制备： • 加热法快速制备：加热96℃－100℃，5分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

  20. 7. 碱变性快速制备： • 先用NaOH作用20分钟，再加HCl中和，离心后取上清，含少量DNA。

  21. 五、DNA的浓缩

  22. 1.固体聚乙二醇（PEG）浓缩： • 用透析袋外敷PEG至合适量。

  23. 2. 丁醇抽提浓缩： • DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。

  24. 3. 乙醇或异丙醇沉淀：

  25. （1）需要阳离子盐的存在 • NaAc最常用， • NaCl对含SDS样品好， • NH4Ac去除dNTP好， • LiCl沉淀RNA好，但不能用于反转录前。

  26. （2）沉淀温度与时间 • 0℃，10－15分钟。

  27. （3）离心 • 0－4℃，12000g，10分钟，小于100bp DNA需超速离心

  28. 4、精胺沉淀法 • 与DNA结合后使DNA结构凝缩沉淀，需在无盐或低盐溶液。

  29. 六. DNA的鉴定

  30. 1. 分光光度法 • 在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.75－1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值表明有RNA的残留量。

  31. 2. 凝胶电泳分析

  32. (1). 影响琼脂糖凝胶DNA 迁移率的因素 • A、DNA的分子大小 • 分子越大迁移速度越慢

  33. B、琼脂糖浓度 迁移率与浓度成反比 • 琼脂糖含量％（W/V） 线性DNA分离范围（Kb） • 0.3 5 - 60 • 0.6 1 - 20 • 0.7 0.8 - 10 • 0.9 0.5 - 7 • 1.2 0.4 - 6 • 1.5 0.2 - 3 • 2.0 0.1 – 2

  34. C、DNA构象 • 相同分子量的超螺旋环状（Ⅰ型），切口环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶， • 一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型

  35. D、电压 • 迁移率与所加电压成正比，但过大有效分离范围变小。>2Kb DNA, 电压<5V/cm。

  36. E、电场方向 • 单一方向速率均等，改变方向，极大分子DNA迁移更慢。通过脉冲电场凝胶电泳分离极大DNA。

  37. （2）. DNA的检测

  38. A、用溴乙锭染色 • 在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易脱嘌呤而断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。

  39. B、用银染法 • Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。

  40. （3）. 分 析 • 通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小。如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好。如分子量小或一片糊状，表示DNA有降解。

  41. 　　为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 Hind Ⅲ消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。

More Related