Separación de poblaciones celulares

1. Separación de poblaciones celulares

2. Diferenciación de las células sanguíneas a partir de células madre de médula ósea

3. Células del sistema inmune

4. Poblaciones celulares en sangre entera Células nucleadas Se producen en medula ósea (humanos a un ritmo de 80 millones por minuto) Se pueden reconocer por sus propiedades de tinción y su estructura interna Leucocitos Nogranulosos • Linfocito • Heterogeneidad morfologica, 6-10um. • Citoplasma basófilo muy escaso. • Puede tener granulaciones escasas • Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se tiñe de color • violeta y estructura compacta. • Monocito • Citoplasma basófilo. • Tiene numerosas granulaciones pequeñas y distribuidas • regularmente (no se ven con aumentos bajos) • Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta claro, • no compacto

5. Basófilo Leucocitos polimorfonucleares Tienen una vida media de 2-3 dias En humanos constituyen el 60-70% de los leucocitos totales de la sangre. No muestran ninguna especificidad para los antígenos pero desempeñan un Importante papel en la inflamación aguda • Neutrófilo • Citoplasma acidófilo color rosa pálido (con eosina ácida se tiñe de amarillo). • Tiene granulaciones neutrofílicas chicas , regularmente distribuidas, abundantes; pueden ser primarios o secundarios • Nucleo multilobulado • 10-20um de diametro • Eosinófilo • Citoplasma acidófilo con granulaciones acidófilas grandes, menos númerosas que en neutrofilos, distribución regular y muy • refringentes • Núcleo bilobulado en forma de anteojos, violeta oscuro y compacto. • Basófilo • Citoplasma acidófilo o antófilo (no toma colorante) • granulaciones basófilas grandes,poco númerosas, distribución irregular de color azul violeta intensos. • Núcleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta oscuro y compacto

6. Tinción de leucocitos en frotis Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar Coloración ideal: May Grunwald (azul de metileno/eosina) Tiñé citoplasma y granulaciones Giemsa (azul de metileno/eosina y azur) Tiñé el núcleo

7. Tipos celulares Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Punción cardíaca Sangre periférica Frotis Monocitos Linfocitos Fórmula leucocitaria (en humanos) En rata, el % de linfocitos es mayor al de neutrófilos (la relación se invierte)

8. Fórmula leucocitaria • Para determinar el porcentaje de los diferentes tipos celulares se cuenta un número fijo de células por frotis (por ejemplo 100), diferenciando los tipos celulares siguientes: linfocito, macrófago y granulocitos. • La diferenciación celular se basa en la relación del tamaño núcleo/citoplasma, la morfología del núcleo y la coloración que adquiere el citoplasma. • Barrer el preparado en guarda griega porque las células no se distribuyen homogéneamente: linfocitos en franja central, monocitos y polimorfos nucleares en el borde. • Las proporciones de la fórmula leucocitaria varían según: • * Edad • *especie (humanos predominan los neutrófilos, rata predominan los linfocitos)

9. Obtención de células de órganos linfoides Sangre Linfocitos T 70 % Linfocitos B 24 % Ganglios linfáticos órganos linfoides secundarios. Linfocitos T 77 % Linfocitos B 18 % Bazo órgano linfoide secundario. Linfocitos T 35 % Linfocitos B 38 % Ganglios axilares Timo Bazo Timo órgano linfoide primario. Linfocitos T 97 % Linfocitos B 1 % Ganglios mesentéricos Ganglios inguinales Placas de Peyer Médula ósea órgano linfoide primario. Generación de células del SI. Capacidad hematopoyética Médula ósea

10. Preparación de suspensiones celulares Obtención de M.O. RPMI 1640 Centrifugar Resuspender en medio de cultivo Contar Obtención de células linfoides • Timo • Bazo • Ganglios

11. ∑n 4 X 10 x dil Nº de células/ml= 4 Recuento de células • Determinación de la concentración de células en una suspensión • cámara de Neubauer

12. Separación de poblaciones celulares • Un método eficiente debe reunir : • Buena recuperación • Alta pureza • Mantenimiento de la funcionalidad celular Sirven para: enriquecer o depletar una población de células

13. 2 g ( - ´) r2 V = 9  Métodos basados en tamaño y densidad Velocidad de sedimentación a 1 x g Ley de Stokes: Fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en un fluido viscoso en un régimen laminar de bajo número de Reynolds (Re< 2000). Una célula que sedimenta obedeciendo la Ley de Stokes (en general es válida para partículas pequeñas moviéndose a velocidades bajas), llega a una velocidad terminal dada por: Densidad de la célula Densidad del medio Radio de la célula Constante gravitacional Viscosidad del medio La temperatura puede modificar la velocidad de sedimentación alterando la viscosidad

14. Densidad celular El diámetro influye más que la densidad de la célula en la determinación de la velocidad de sedimentación

15. Separación en base al tamaño principalmente (medio de baja densidad) • Ventajas: • Buena reproducibilidad • Buena recuperación • Puede separar una gran cantidad de células • Desventaja: • Tiempo requerido para la separación

16. Separación en base a la densidad • Centrifugación en gradiente de densidad: • utiliza un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. • el gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un • solvente en el que la muestra a analizar puede ser suspendida • permite separar los componentes de una muestra • realizar medidas analíticas • Dos variantes: Centrifugación zonal: la muestra se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partículas sedimentan moviéndose a diferentes velocidades dependiendo de su masa. Centrifugación isopícnica : la muestra se disuelve en una sn en donde está el soluto formador del gradiente. Durante la centrifugación el soluto se distribuye en el tubo y las particulas de la muestra se reorientan de acuerdo a su densidad. (sedimentación a altas g a través de un medio cada vez más denso)

17. Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio. Las células muy densas llegan al fondo del tubo y pueden morir por compresión. Las células muertas también son muy densas y llegan al fondo del tubo. Se utilizan altas g para alcanzar más rápido el equilibrio y evitar mezclas por efectos de difusión. Cuanto mayor es la relación núcleo : citoplasma, mayor es la densidad de la célula Medio hipotónoico: células menos densas; medio hipertónico: células más densas Se utilizan gradientes de BSA lineales o discontinuos y sílica gel coloidal, Percoll.

18. Separación en base a tamaño y densidad (Hypaque-Ficoll) Separación de una suspensión celular a través de un medio de alta densidad por centrifugación a baja velocidad Ficoll. Se trata de un polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Presenta un alto contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena solubilidad en medios acuosos. Además no presenta grupos ionizables que puedan servir de unión a las muestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin degradarse. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque sigue siendo algo elevada, lo que supone un inconveniente y no altera la presión osmótica del medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separación de células y partículas subcelulares mediante centrifugación zonal. Densidad del medio para células humanas : 1,075 g/cm3 ratón : 1,09 g/cm3 rata: 1,089 g/cm3

19. Ficoll Hypaque Polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina Hypaque sódico (diatrizoato sódico) sodio 3,5-diacetamido-2, 4, 6-triiodobenzoate (C11H8I3N2NaO4) contiene 59.87 % de Iodo (C12H22O11)n.(C3H5ClO)n PM: 400.000

20. Obtención de células mononucleares de sangre periférica por Ficoll- Hypaque Antes de centrifugar Después de centrifugar Centrifugación Plasma y plaquetas Sangre diluida Mononucleares 400 g 30´ temp amb Ficoll Hypaque Ficoll Hypaque Polimorfonucleares + Glóbulos rojos Mononucleares: Linfocitos + monocitos

21. Purificación de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque • Por sedimentación sobre dextran 6 % Agitación por inversión y sedimentación por 30’ Dextran PMN + GR * Lisis con H2O (1’) Llevar a isotonicidad PMN + GR + SF GR El dextran es un polisacárido complejo y ramificado formado por muchas moléculas de glucosa unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones glucosídicas α1->6 entre moléculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en uniones α1->4 (en algunos casos también en uniones α1->2 y α1->3). El dextrano es sintetizado a partir de la sacarosa por ciertas bacterias ácido-lácticas( Leuconostoc mesenteroides y Streptococcus mutans).

22. 50 % (1065) Mononucleares (linfocitos) Plasma Monocitos, NK 60 % (1077) PMN 70 % (1083) GR Separación de células sanguíneas humanas por centrifugación en gradiente de Percoll • Gradiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperación y pureza mayor al 90 % • Percoll. • Se trata de una suspensión de partículas (5.15 nm) de ácido silícico revestidas de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP)que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta prácticamente a la presión osmótica del medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y 10. • Es soluble en solución acuosa y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos pH. • El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para centrifugación isopícnica, ya que la centrifugación de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial del percoll. Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio.

23. Métodos basados en adherencia • 3 categorías: • 1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura dependiente (ej: macrófagos, polimorfonucleares) • 2- Adherencia física: Se puede realizar a 4 °C o a 37 °C (ej: subsets de células B) • 3- Adherencia de células muertas o dañadas • Sustancias empleadas: • Sephadex G10: Quedan retenidas las células adherentes. • La separación se basa en adherencia y tamaño. • Polvo de hierro (Carbonyl iron powder): Las células que fagocitan o se adhieren a las partículas de hierro, son removidas con un imán. (ej: Remoción de linfocitos B) • Lana de nylon: Se utiliza para obtener células T libres de células B. • El rendimiento es bajo (15 a 25 %). • Puede haber retención diferencial de subpoblaciones T. • Adherencia a superficies de vidrio o plástico

25. Métodos basados en adherencia Rendimiento bajo (15-25 %) Alta pureza. Adherencia a superficies de vidrio o plástico Adherencia a lana de nylon * Purificación de macrófagos (células adherentes) * Separación por agentes químicos (quelante de calcio, EDTA o tripsina) o por rastrillado. * Purificación de linfocitos T

26. Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando) *Rosetas *Columnas con anticuerpos *Panning: superficies plásticas recubiertas con anticuerpo *Beads magnéticas *Aglutinina de maní:interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros, aglutinando las células (las células maduras presentan éstos residuos enmascarados por ácido siálico. *Aglutinina de soja: aglutina células B pero no células T. *FACS

27. Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando) A partir de interfase de Ficoll- Hypaque Rosetas espontáneas GRc GRc GRc GRc GRc GRc CD 2 LT (humanos) Ficoll-Hypaque Monocitos + LB LT Rosetas T Roseta

28. Métodos basados en afinidad

29. Panning Beads magnéticas Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y superficies plásticas recubiertas con anticuerpos CD 3 (Linfocito T) CD 19 (Linfocito B) Utilización de pequeñas beads recubiertas con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a los linfocitos T o B. Una vez hecha la unión las células se extraen con la ayuda de un separador magnético. La pureza es excelente. Se trabaja a temperatura ambiente Selección positiva Selección negativa

30. Técnicas inmunomagnéticas

31. Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en la especificidad de la interacción) Antisuero + complemento: Eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.

32. Otros métodos de separación Método basado en filtración por columna de bolitas de vidrio 53 a 65 µ de diámetro Las células más grandes se retrasan con respecto a las más pequeñas. El vidrio debe estar siliconado Metodo basado en carga eléctrica neta En roedores hay una distribución bimodal de movilidades correspondiendo a células B y T. En humanos esa distribución no se puede correlacionar con las poblaciones B y T

33. La timidina se incorpora al ADN celular Métodos basados en la separación funcional por inactivación de células proliferantes 1- Pulso de timidina marcada con radioisótopos Linfocitos expuestos a Ag o mitógenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN La desintegración radioactiva mata las células proliferantes. (Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotóxicas mediadas por células). X

34. 2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR) Se incorpora al ADN en células en división como análogo de la timidina. Cuando se activa con luz UV, causa el daño del ADN. 3- Mitomicina C Causa cross-linking del ADN y las funciones que requieren división celular son abolidas 4- Irradiación Rayos X, Cobalto (60Co), Cesio (137Cs), rayos gamma. X