Glükozamin talajból történő meghatározása

1. Készítette: Bukri Gergely Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2011 Glükozamintalajból történő meghatározása

2. Az aminocukrok jelentős mértékben hozzájárulnak a talaj szerves nitrogén tartalmához (5-12%), ez részben a mikrobiális eredetnek köszönhető. (Stevenson 1982; Joergensen és Meyer 1990) • A talajban megtalálható legfontosabb aminocukrok a glükozamin, agalaktózamin és a muramin sav, bár számos más aminocukor is létezik. (Stevenson 1983; Amelung 2001) • A talaj glükozamin tartalmának meghatározása segítségével tudjuk becsülni a biomassza nagyságát. Ez azért lényeges, mert a biomassza mint indikátor figyelmeztet a kedvezőtlen változásokra.

3. A prokarióták sejtfalának egy sajátos vegyülete a peptidoglikán, amelyben N-acetil-glükozamin (N-acetil-2-amin-2-dezoxi-D-glükóz) és N-acetilmuraminsavláncai kapcsolódnak egy alaninból, glutaminból és lizinből vagy diamino-pimelinsavból álló tripeptidhez. Glükozamin a prokariótákban

4. Számos gomba sejtfala - beleértve a magasabb rendűeket is - tartalmaz kitint (Bartnicki-Garcia 1968), amit főleg N-acetilglükozamin épít fel, továbbá a gerinctelen állatok kitinvázában is megtalálható. A gombák glükozamin tartalma igen széles skálán változik, függ a fajtól, a fejlődési ciklustól (mérettől) és az életkortól is. A talajban lévő glükozamin nagy részét fedezi ez a forrás. Glükozamin a gombákban

5. A talajmintákból a glükozamin erősen savas, HCl-al (sósav) végzett hidrolízis segítségével mutatható ki. Ezt a lépést kation-cserélőn történő kromatográfiás tisztítás követi (Frankland et al 1978). Ahhoz, hogy a kation-cserélős lépés elhanyagolható legyen, Grant és West (1986) glükozamint határoztak meg talaj hidrolizátumból papír kromatográfiás módszerrel. Glükozamin kimutatása talajmintákból

6. A mennyiségi meghatározás kivitelezhető kolorimetriásan (Zelles et al 1987), de sokkal pontosabb eredményhez jutunk gázkromatográfiás (Hicks és Newell 1983) vagy HPLC (nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiás) technológia alkalmazásával (Zelles 1988). Glükozamin kimutatása talajmintákból

7. Aaronson 1981-ben arról számolt be, hogy a kitin koncentrációja a különböző gombafajokban 10 és 250 mg/g között mozgott szárazanyagra vonatkoztatva. Hicks és Newell 1984-ben leírták, hogy a glükozamin-tartalom 8,5-től 92,8 μg/mg –ig változott szárazanyagra vonatkoztatva. Grant és West 1986-ban 505-2109 μg mennyiséget mért, Zelles és társai 1990-ben pedig 3500 μg körüli értéket az erdei talajok szerves rétegében és 137-479 μg-ot az erdei talajok ásványi rétegében. A glükozamin és kitin kapcsolata

8. West és társai 1987-ben úgy vélték, hogy a tárolásnak nincsen nyilvánvaló hatása a glükozamin koncentrációjára, ezzel szemben pár évvel később Zelles csapatával arra a következtetésre jutott, hogy a mintában a tárolás során megnőtt a glükozamin koncentrációja (Zelles et al 1991). Mindezek alapján megállapítható, hogy a vizsgálatok során nem lehet figyelmen kívül hagyni a tárolás hatásait. Minták tárolása

9. Ha a glükozamin-elemzést használjuk a gombás biomassza felmérésére, jelentős problémaként jelentkezik, hogy glükozamin-többlettel kell számolni a prokarióták és gerinctelenek mintában való jelenléte miatt. Első lehetőségként a glükozamint el lehet számolni úgy, hogy felmérjük a muramin sav mennyiségét a mintában és feltételezzük, hogy muramin sav – glükozamin mólaránya 1:1. Glükozamin többlet

10. A muramin sav elemzése során azonban a glükozamin meghatározásának fő problémája, hogy a glükozamin jelen van a nem-élő szerves anyagban (Tunlid and White 1992). A biomassza adatok alapján történő számszerű kiértékelések már korábban is igazolták, hogy a nem-élő szerves anyagokban jelen lévő glükozamin jelentősen hozzájárul az összglükozamin-koncentrációjához. (Grant and West 1986). Glükozamin többlet

11. A muraminsav meghatározásának menete alkalmazható a glükozamin meghatározásánál is. Minden a muraminsavnál leírt paraméter érvényes a glükozamin tesztre is. Glükozamin többlet

12. A módszer a glükozamin talajból történő extrakcióján, a HCl-al történő hidrolízisen, valamint a papírkromatográfiát követő mennyiségi meghatározáson alapul. A módszer elve

13. Spektrofotométer Rotációs bepárló Kromatográfiás papír Kromatográfiás kamra Rotációs rázógép Vízfürdők állítható hőmérséklettel (15°C-100°C) Szűrőpapír (Whatman GFC) Centrifuga és csövek Anyagok és készülékek

14. HCl (12 M) Trimetilklór (1% toluolban) Pelyhes NaOH Mozgó fázis I Bután-1-ol/piridin/ecetsav (tömény) / víz (60:40:3:30 v / v) Mozgó fázis II Piridin/víz (4:1 v / v) Ninhidrin reagens H2SO4 (koncentrált) Metanol Glükozamin standardoldat Vegyszerek és megoldások

15. Részminta előkészítés, extrakció és vizsgálati eljárás alkalmazása a talaj glükozaminra megegyezik az diaminopimelinsavnál használatossal a következők teljesülése esetén: A talajmintákat inkubáljuk 10 ml HCl-al (12 M), 25 °C-on, N2-áram alatt 48 óra, majd hígítjuk desztillált vízzel (30 ml) és N2–áram alatt hidrolizáljuk 100 ° C-on 6 órán át. Glükozamin meghatározása talajmintából i.

16. A hidrolizátumok szűrleteit kiegészítjük 100 ml-re (desztillált vízzel), hozzá adunk 10 ml részmintát, majd kromatografáljuk az eredeti glükozamin oldat térfogatával 48 órán át első osztályú Whatman szűrőpapíron 60:40:3:30 (v / v) oldószer arány mellett. Glükozamin meghatározása talajmintából iI.

17. 4-5 nap elteltével glükozamin foltok jelennek meg a szűrőpapíron, melyeket tömegállandóságig szárítjuk, majd analitikai mérlegen visszamérünk.A homogenitás tesztelésére a piridin:víz (4:1 v / v) arány mellett végzett kromatográfia alkalmas. Megjegyzés: A glükozamin-veszteség az extrakció és az elemzés során igazoltan mintegy 8%. A meghatározás eredménye

18. Alef K. and Nannipieri P. (Editors): MethodsinAppliedSoilMicrobiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 • http://www.tankonyvtar.hu/biologia/oxford-typotex-biologiai-080905-52 • http://www.akademiai.com/content/w0795655426r4831/ • Képek: http://www.everystockphoto.com/photo.php?imageId=1667167 Felhasznált irodalom