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L’ANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia

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L’ANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia AO Ospedali Riuniti di Bergamo. Diagnosi microbiologica. Il ruolo dei laboratori di microbiologia clinica consiste essenzialmente nell\'effettuare una diagnosi presuntiva

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L’ANTRACE:

DIAGNOSI MICROBIOLOGICA

Antonio Goglio

Microbiologia e Virologia

AO Ospedali Riuniti di Bergamo

Antrace 4 - www.apsi.it

diagnosi microbiologica
Diagnosi microbiologica
  • Il ruolo dei laboratori di microbiologia clinica consiste essenzialmente nell\'effettuare una diagnosi presuntiva
  • Tutti i laboratori debbono essere in grado di sospettare la presenza di B. anthracis
  • Nel sospetto il campione e/o le colture devono essere inviate ad un laboratorio, che possegga aree di lavoro corrispondenti al terzo livello di contenimento (P3), per la diagnosi definitiva.

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b anthracis
B.anthracis
  • è aerobio e anaerobio facoltativo
  • immobile, sporigeno e, se ceppo virulento, capsulato
  • non-emolitico su agar sangue di montone
  • sensibile alla penicillina (salvo rarissimi ceppi, più spesso modificati)
  • può presentarsi in due diverse forme:
    • in forma vegetativa (1-1,5 x 3-8 m)
    • in forma di spora (1 m).

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b anthracis forma vegetativa
B.anthracis: forma vegetativa
  • la forma vegetativa (fase di attiva moltiplicazione) è quella che si riscontra nelle lesioni cliniche, nei relativi campioni biologici e di conseguenza nelle colture microbiologiche
  • solo la forma vegetativa è in grado di produrre le tossine (antigene protettivo, fattore letale, fattore edemigeno) e la capsula , due dei fattori di virulenza
  • tale forma vegetativa è facilmente distrutta dai disinfettanti comunemente utilizzati in ospedale, in particolare da quelli a base di cloro

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b anthracis spore
B.anthracis: spore
  • la forma di spora (fase di quiescenza) è quella che il microorganismo acquista in situazione di svantaggio e gli consente la sopravvivenza (in presenza di ossigeno atmosferico, nella terra e nel suolo, in acqua, polveri, pellami, ….)
  • solo nel momento in cui si ritrova in un ambiente favorevole (inoculazione di spore attraverso lesioni cutanee, ingestione con acqua o alimenti, inalazione di un’elevata quantità di spore) riprende la capacità di moltiplicarsi e di dare danno
  • le spore sono particolarmente resistenti nell’ambiente (sopravvivono anni) e non sono distrutte dai comuni disinfettanti

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biosicurezza 1
Biosicurezza (1)
  • B. anthracis non è contagioso da persona a persona
  • L\'infezione cutanea avviene solo attraverso soluzioni di continuo della cute e la forma da inalazione necessita di una elevata carica di spore, per cui il rischio di trasmissione in laboratorio è praticamente nullo
  • Per i campioni potenzialmente infetti, adottare misure almeno del 2° livello di contenimento (cappa a flusso di classe 2 con filtri HEPA, indumenti di protezioni personale -camici monouso, guanti di lattice, mascherine, occhiali o schermi di protezione-)

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biosicurezza 2
Biosicurezza (2)
  • Le procedure devono essere eseguite da microbiologi o tecnici di microbiologia esperti
  • Nel caso si giunga ad una identificazione presuntiva della presenza di B.anthracis, è sconsigliato allestire ulteriori procedure identificative. Il campione e/o la coltura devono essere inviati ad un laboratorio di riferimento per la diagnosi definitiva.

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decontaminazione
Decontaminazione
  • Le superfici che possono essere state a contatto con materiali infetti devono essere decontaminate con prodotti a base di cloro in concentrazione di:
    • 5.000 ppm (es. ipoclorito di sodio 5,25% -la comune candeggina- diluito 1:10) *
    • 10.000 ppm (come sopra, diluendo 1:5) **
  • Gli altri materiali devono essere autoclavati seguendo le procedure in vigore nel laboratorio per i materiali infetti
  • il CDC consiglia l’uso di diossido di cloro (gas) per il trattamento di ambienti contaminati da spore
  • CDC, Guidelines for State Health Dpt (14.10.01)
  • PHLS Provisional guidelines for action in the event of a deliberate release (11.10.01)

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esame diretto dei campioni clinici
Esame diretto dei campioni clinici
  • Allestire due vetrini con uno striscio del materiale in esame: fissarli per 1 minuto con etanolo assoluto oppure 10 min con metanolo
  • Colorare un vetrino con il Gram e uno con il Giemsa e osservarli al microsopio in immersione
  • La presenza al Gram di grossi bacilli Gram-positivi (1-1.5 X 2-8 mm), con estremità squadrate e in corte catene di 2-4 cellule suggerisce la presenza di B. anthracis
  • La colorazione di Giemsa può mettere in evidenza la presenza di capsula

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gram di b anthracis da sangue di scimmia 1000x
Gram di B. anthracis da sangue di scimmia (1000x)

www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

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gram di b anthracis da agar sangue 1000x
Gram di B. anthracis da agar sangue (1000x)

www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

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gram di b anthracis con spore 1000x
Gram di B. anthracis con spore (1000x)

www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

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esame colturale 1
Esame colturale (1)

Tampone nasale

  • semina diretta su piastre di AS
  • utile anche semina dopo trattamento termico o con alcool per eliminare la flora commensale
    • stemperare il tampone in 1 ml circa di diluente (soluzione fisiologica o brodo) e sottoporre la sospensione a shock termico (bagnomaria a 65°C per 10 min.), oppure a shock etanolico (aggiungere pari volume di alcool etilico assoluto per 30 min.)
    • dopo trattamento possono essere seminate, per inondazione, una o più piastre di AS con 0,1 ml della sospensione.

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esame colturale 2
Esame colturale (2)

Altri campioni

  • B.anthracis cresce rapidamente sui comuni terreni colturali, ma non su MacConkey
  • allestire una coltura su Agar Sangue di montone (AS): su questo terreno è possibile evidenziare alcune caratteristiche distintive di B.anthracis
  • allestire in contemporanea colture su altri tipi di terreni, secondo le procedure in uso nel laboratorio per i diversi tipi di campioni clinici
  • incubare a 35°-37° C in un termostato ad aria per 18-24 ore

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caratteristiche colturali 1
Caratteristiche colturali (1)

Aspetto delle colonie (su AS dopo 15-24 ore a 35-37°C)

  • colonie di 2-5 mm, biancastre, a vetro smerigliato, rotonde o irregolari, piane o leggermente convesse, con margini frastagliati e proiezioni a forma di virgola che protrudono dal bordo della colonia (aspetto a “caput Medusae”)
  • non emolitiche, a differenza di quelle di altre specie, quali B. cereus e B. thuringiensis, che producono su AS beta emolisi (emolisi completa)
  • con consistenza notevole, appiccicose e filanti, quando raccolte con un\'ansa

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caratteristiche colturali 2
Caratteristiche colturali (2)

Aspetto delle colonie (su Agar cioccolato dopo 15-24 ore a 35-37°C)

  • mucose, se il ceppo è capsulato
  • la capsula si forma in presenza di CO2, o in terreni contenenti bicarbonato di sodio 0,7%

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caratteristiche colturali 3
Caratteristiche colturali (3)
  • La rapidità di crescita (12-15 ore ) di B. anthracis può essere sfruttata per isolare il microrganismo da una coltura mista
  • Al Gram i batteri cresciuti su AS in aria:
    • non presentano capsula
    • appaionocome lunghe catene di bacilli Gram-positivi
    • contengono spore, più o meno numerose, centrali o subterminali, ovali, che non dilatano il corpo batterico.

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morfologia delle colonie di b anthracis da agar sangue dopo 18 24 ore
Morfologia delle colonie di B. anthracis (da agar sangue, dopo 18-24 ore)

www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

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colonie appiccicose di b anthracis da agar sangue
Colonie “appiccicose” di B. anthracis, da agar sangue

www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

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test addizionali
Test addizionali

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b cereus destra e b anthracis snistra su agar sangue dopo 24 ore
B. cereus (destra) e B. anthracis (snistra), su agar sangue, dopo 24 ore

www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf

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fonti bibliografiche
Fonti bibliografiche
  • ISS (www.iss.it)
  • JAMA, 1999, Consensus statement
  • N Engl J Med, 1999, Dixon e al.
  • CDC (www.asmusa.org/pcsrc/ban.asm.la.cp.102401f.pdf)
  • PHLS (www.phls.co.uk/advice/anthrax_guidelines.pdf)
  • links: www.apsi.it

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