第一节 DNA 的生物合成

第一节 DNA的生物合成

一. DNA的复制 复制部位：真核生物：细胞核原核生物：细胞质的核质区

(一) 复制的反应 n1d ATP DNA聚合酶 n2d CTP DNA +（n1+n2+n3+n4)PPi n3d GTP DNA模板 n4d TTP PPi随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。

(二) 复制的方式 半保留复制 DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先解旋并分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，各形成一条互补链。这样，从亲代的一个DNA双螺旋分子复制成两个与亲代的碱基序列完全相同的子代DNA分子。每个子代DNA分子中，有一条链来自亲代DNA，另一条则是新形成的，这样的复制方式叫做半保留复制（semiconservative replication）。

(二) 复制的方式 半保留复制

(二) 复制的方式 如何证明半保留复制 1958年，Meselson 证明：用，15NH4Cl唯一氮源培养大肠杆菌，之后，用14NH4Cl培养，然后进行CsCl2进行密度梯度离心。由于15NH4Cl密度大于14NH4Cl，因此，形成不同区带，经过若干代培养后，两个14NH4Cl区带增多。

(二) 复制的方式 半保留复制全保留复制

(三) 复制反应注意点 DNA复制除DNA聚合酶, DNA模板, dNTP外,还需要多种蛋白质因子、引物、Mg2+等。特点： A 对利福平不敏感 B 核糖核酸代替脱氧核糖核酸

(四)参与复制的酶和蛋白质 1. DNA聚合酶(DNA polymease)

1. DNA聚合酶(DNA polymease)

1. DNA聚合酶(DNA polymease) 3'→5'核酸外切

5'→3'核酸外切

2. 引物酶(primer) 合成RNA引物，又叫引物合成酶、引发酶。它以单链DNA为模板，以ATP、GTP、CTP、UTP为原料，从5→3方向合成出RNA片段，即引物。

3. DNA连结酶 (DNA ligase) 催化DNA双链中一条链上的缺口（3′-OH 与它下游相邻的核苷酸的 5′-磷酸之间）共价连结（形成磷酸二酯键）。连结过程需要能量，E.coli和某些细菌中由NAD+提供；动物细胞由ATP提供。

3. DNA连结酶 (DNA ligase)

解螺旋酶(helicase)： 将DNA的两条链打开。每解开一对碱基需要水解2分子ATP。方向为5’-3’，大肠杆菌中的解螺旋酶又叫rep蛋白，但方向为3’-5’ 。 4. 使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质

单链结合蛋白(SSBP)： 与解链后的DNA单链结合，阻止其再次形成双螺旋。大肠杆菌SSB为177 aa多肽，以四聚体形式存在，与32个bp DNA区相结合，结合后的DNA 分子僵硬，不易弯曲，有利于单链DNA分子的稳定，避免核酸酶进攻；同时降低了Tm值，进一步促进DNA的解链。 4. 使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质

旋转酶(gyrase,untwisting protein)： 催化DNA的拓扑连环数发生变化。可分为拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ。 Ⅰ型酶可减少负超螺旋；Ⅱ型酶可引入负超螺旋（此时需要ATP提供能量）。具有内切酶和连接酶活力，参与DNA复制前双螺旋的松弛及复制后超螺旋的再恢复。 4. 使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质

dn蛋白(mobile promoter)： 功能：识别DNA的合成的起始位置，与引物酶及其它一些蛋白组成复合体启动RNA引物链的合成。 4. 使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质

（五）复制的过程 1. 复制的启动复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启动第二轮复制；真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制过程。

1. 复制的启动 复制过程的调控主要取决于复制启动的频率，而DNA延长的速度大体上是恒定的。由于真核生物在多位点上启动复制，所以尽管其DNA比原核生物DNA大得多，但复制的总速度反而比原核生物快。 DNA的复制是由引发体识别并结合于复制原点而被启动的，其机理比较复杂，目前还不十分明了。

2. 复制眼的形成 由于复制原点都是在DNA分子的内部，而不是在末端，所以当复制启动后需要在复制原点处将DNA双螺旋局部解链，形成“眼状”结构 —— 复制眼。

2. 复制眼的形成 复制眼的结构：复制眼形成后，其两端的叉子状结构称为复制叉。

2. 复制眼的形成-双螺旋解开的过程 解螺旋酶使DNA双螺旋局部解链； SSB结合到解开的单链上；拓扑异构酶Ⅱ向DNA中引入负超螺旋，以消除由解链产生的扭曲张力(动画)。

（五）复制的过程 一.DNA的复制

3.复制叉的推进 (1) 复制叉推进的方式随着复制叉的推进，两条新链的合成方向是不同的：一条链延伸的方向与复制叉前进的方向一致，它的合成能连续进行，称为前导链；

3.复制叉的推进-复制叉推进的方式 另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向相反，它显然不能被连续合成，需要复制叉推进了一定的长度，有了一段DNA单链后，才能以此为模板合成一个片段。因此这条新链的合成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为随后链。

3.复制叉的推进-复制叉推进的方式 这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为半不连续复制。随后链中合成的多个DNA片段，称为冈崎片段。冈崎片段的长度原核细胞中约1000~2000个核苷酸，真核细胞中约100~200个核苷酸。

3.复制叉的推进-复制叉推进的过程 ① 先导链的合成引物酶在复制原点附近合成一段RNA引物； DNA聚合酶Ⅲ (原核细胞)在引物的3'末端逐个添加脱氧核苷酸。随着复制叉的推进，亲代DNA双螺旋不断被解开，先导链也不断延伸。

引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成 RNA引物。也是由引物酶催化。冈崎片段的合成：DNA聚合酶Ⅲ(原核细胞)在引物的3'末端使DNA链延伸，直至抵达其下游的另一个冈崎片段的RNA引物的5'端。 3.复制叉的推进-复制叉推进的过程 ② 随后链的合成

冈崎片段的连结：DNA聚合酶Ⅰ一面以其DNA聚合活性在上游冈崎片段的3'-OH末端添加脱氧核苷酸，一面以其5'→3'核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切除。冈崎片段的连结：DNA聚合酶Ⅰ一面以其DNA聚合活性在上游冈崎片段的3'-OH末端添加脱氧核苷酸，一面以其5'→3'核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切除。 DNA连接酶将最后的缺口补好。 3.复制叉的推进-复制叉推进的过程 ② 随后链的合成

3.复制叉的推进-复制叉推进的过程 ③ 先导链和随后链中DNA的延伸由同一个DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚体催化随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方向与先导链的延伸方向一致，它们的3'末端分别落在DNA聚合酶Ⅲ全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶的移动，两条链同时延伸。

4.复制的结束 复制的终止没有特殊的信号 • 原核生物中： • 其环状的DNA从单点开始双向复制，当两个复制叉在复制原点的对面处相遇并合并时，结束复制，形成两个环状DNA分子。

4.复制的结束 复制的终止没有特殊的信号 • 真核生物中： • 其线状的DNA上有多个复制原点，因此形成多个复制眼，复制叉的推进使复制眼增大，直至各个复制眼融合，复制终止，形成两个线状DNA分子。

5.端粒复制

（六）DNA复制的忠实性 差错率为10-9-10-10 • 新合成的子链与母链之间碱基配对严格性 • 使用引物RNA • DNA聚合酶对底物专一性 • DNA聚合酶的校对作用 • 5. DNA修复机制

二. DNA的损伤与修复 DNA分子的完整性对细胞至关重要，这一点是其它生物分子无法比拟的。在生物的进化中，DNA复制中可因DNA聚合酶催化作用引发出偶然的错误。环境因素（如辐射、紫外光照射、化学诱变物等）也可引起DNA序列上的错误，这些错误若不能予以改正而保留下来，会直接影响机体的生理功能，以致影响到后代的正常生长和发育。但是，生物体内存在有效的修复（repair）体系，保证了DNA复制的高度精确性。

1. DNA损伤的原因 • 外环境中的射线：X-射线、紫外线等—— 高剂量的紫外辐射使DNA链上邻近的嘧啶核苷酸之间形成化学键，生成二聚体；此外还有脱嘌呤作用和脱氨基作用.

2. 修复 所有细胞对DNA的损伤都有一定的修复能力，以恢复正常的DNA结构。修复的方式：光修复、切除修复、重组修复、SOS修复 (1) 光修复由DNA光裂合酶（photolyase）催化。该酶需要光（400700 nm）才能激活，它能切除嘧啶二聚体之间的连键(C-C键)，从而修复由紫外照射而造成的损伤。

2. 修复 (2) 切除修复该类修复是指在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出新的被切去的部分，然后使损伤的DNA恢复正常结构的过程。切除修复系统可对多种损伤起修复作用。切除修复有核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）和碱基切除修复（base excision repair, BER）两种。

2. 修复 (2) 切除修复修复机制: 其过程是：切→补→切→缝由专一性核酸内切酶催化，在离损伤处附近切断由DNA聚合酶在断口处进行DNA合成由5′核酸外切酶将损伤部位切掉由连接酶将新合成的DNA链与原来的链连接

2. 修复 (3) SOS修复细胞在紧急状态下，能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA的损伤部位进行复制，从而避免了死亡，但产生很高的变异率。

2. 修复 (3) SOS修复

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