Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science

1. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 受体研究技术 Techniques in receptor research 韦日生 北京大学医学部生物物理学系 2006年3月

2. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第八章 组织化学技术在受体定位中的应用 第一节 在受体定位中免疫组化的原理和方法 免疫组化的原理 免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)﹐其主要原理是用标记的抗体对细胞或组织内的相应抗原(受体)进行免疫化学反应,经过组织化学呈色后用显微镜观察受体在组织细胞中的分布和定位。 膜受体或核受体Ag 制备相应的特异性抗体 标记抗体 免疫组织化学测定

3. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫组织化学优缺点 高特异性: 抗原抗体反应是特异性强,识别能力可达到单个氨基酸水平. 高度敏感性: 使用高敏感的和高亲和力的抗体﹐ 可检出细胞和组织内超微量的抗原成份。 高分辨能力: 经呈色反应 ,在受体原位形成有色沉淀或荧光, 其分辨能力远大于放射自显影技术。 免疫组织化学方法唯一的缺点是 无法测定受体-配基反应的 亲和性(Kd值)

4. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫组织化学的全部过程 包括﹕ 1.抗原(受体)提取和纯化 抗原可为完整蛋白或一段特异性片段。 2.免疫动物或细胞融合(单克隆抗体)。 3.抗体效价检测和提取。 4.抗体标记。 5.细胞和组织标本的制备。 6. 免疫组织化学反应和显色。 7.观察和记录结果。

5. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫组织化学标本的制备 抗原(受体)的准确显示和定位与制备的组织和细胞标本质量密切相关 细胞和组织标本的取材 细胞和组织的固定 组织切片 *细胞和组织标本的取材 细胞标本 :细胞涂片 组织标本: 取新鲜组织,速冻或立即用固定剂固定.

6. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science *细胞和组织的固定 保持细胞和组织的原有结构, 防止组织自溶.不仅使细胞和组织内蛋白质凝固，终止和抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度地保存 细胞和组织的抗原性及防止抗原的扩散。 1 固定剂一般为醛类固定剂和醇类固定剂 醛类固定剂 醛类为交联剂，其作用是交联组织中的氨基，保存抗原于原位。其特点是组织穿透力强，收缩小。 常见有:福尔马林 , 多聚甲醛 等 丙酮及醇类固定剂 该类固定剂为沉淀剂, 其作用是沉淀蛋白质和糖, 组织穿透性很强, 保存抗原的免疫活性较好 . 如乙醇 ,氯仿, 冰醋酸 等

7. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 固定组织时应注意: *力求保持组织新鲜, 勿使其干燥, 尽快固定处理. *组织块不易过大过厚, 必须小于 2cm x 1.5cm x 0.3cm, 尤其是组织块厚度须保持在0.3cm 以内. *固定剂必须有足够的量, 在体积上一般大于组织20倍。 *组织固定后, 应充分水洗, 去除固定剂, 以减少固定剂造成的人为假像.

8. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science *组织切片 切片厚度一般为 6μm ,神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm 冰冻切片 最突出的优点是能够较好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原(如膜受体)更应采用冰冻切片.冰冻时注意减少冰晶形成. 石蜡切片 其优点是组织结构保存良好, 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值, 能连续切片, 组织结构清晰, 抗原定位准确. 振动切片 用振动切片机 (Vibratome) , 对新鲜组织 切片, 组织不用固定和冰冻,也没有石蜡包埋. 载玻片处理

9. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫组织化学方法 免疫荧光组织化学 免疫酶组织化学 (一) 免疫荧光组织化学 免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗体标记上荧光素， 再用这种荧光抗体作为探针检测细胞内相应的抗原。 由于免疫组织化学的特异性、快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性， 免疫荧光组织化学是免疫组织化学中广泛应用于受体定位的技术之一

10. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫荧光组织化学 分直接法, 夹心发, 间接法和补体法. 其中直接法和间接法最为常用。 直接法 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞中的抗原相结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现特异性荧光. 间接法 先用Ab1与 组织Ag结合,再用标记荧光的Ab2与Ab1结合 形成抗原--抗体--荧光抗体复合物 染色方法: BSA封闭---PBS冲洗---一抗--- PBS冲洗---二抗--- PBS冲洗---(防荧光淬灭封固剂 或90% 甘油 PBS )封片

11. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫荧光组织化学间接法 A.用免疫荧光组织化学间接法显示角质细胞生长因子受体(Keratinocytew Growth Factor receptor, KGFR)定位于细胞的细胞膜。B.在KGFR抗体孵育液中加入过量KGFR，染色结果为阴性。标尺：50um , (Yuan et al. Gastroenterology 2002, 122(Suppl):866)

12. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 双重免疫荧光染色 双重免疫荧光染色可在同一组织细胞标本上同时显示两种受体 直接法 A 抗体用异硫氢酸荧光素(FITC) 标记 一抗 按适当比例混合 B 抗体用得克萨斯红 (TR) 或四乙基罗丹名 (TRITC) 标记 标记组织抗原 间接法 是目前最广泛应用的双重免疫荧光组织化学技术。所用的一抗必需是来自不同种属动物的两种特异性抗体 (例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔。B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。二抗为两种不同荧光素标记 (如 FITC和TR) 抗产生一抗的不同种属动物的IgG (例如：FITC标记的羊抗兔IgG， TR标记的羊抗小鼠IgG)。

13. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science (二) 免疫酶组织化学 它是在抗原抗体特异反应存在的前提下， 借助酶组织化学的手段，检测某种物质在组织细胞中的定位： 即先将抗体与酶连接，抗体与组织内特异抗原反应，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成份的定位.

14. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 用于标记的酶应具备以下特点 ① 酶催化的底物必须是特异的且易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察； ② 所形成的终产物沉淀必须稳定, 即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散， 影响组织学定位。 ③ 酶标记过程中，酶与抗体连接不影响二者的活性。 ④被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物

15. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 最常见的酶标记物 辣根过氧化物酶 (Horsh Radish Peroxidase, HRP) 具有稳定性强和反应特异高等优点, 且主要分布于植物中, 是目前应用最多的酶标记物. 碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP) 葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)也较为常用 HRP的特异底物为H2O2，在分解H2O2过程中，与H2O2形成复合物. 目前应用最为广泛的免疫酶组织化学方法: *过氧化物酶-抗过氧化物酶法 (Peroxidase Antiperoxidase method, PAP 法) *卵白素--生物素--过氧化物酶复合物法 (Avidin Biotin--Peroxidase Complex Method, ABC 法)

16. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 过氧化物酶抗过氧化物酶法 (PAP 法) 该方法的基本原理为 PAP 复合物中的抗HRP抗体和第一抗体来自相同种属的动物，特异性一抗与组织细胞中抗原结合，二抗作为桥抗体将过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物(PAP)连接在与组织细胞内抗原结合的一抗上. 卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-Peroxidase Complex Method, ABC法 ). ABC 复合物是将 HRP 连接在生物素上,再将生物素--HRP与卵白素结合而成。 ABC法的基本原理是特异性一抗与组织细胞中抗原结合， 生物素标记的二抗再与一抗结合， ABC复合物中的卵白素分别连接生物素标记的二抗和生物素标记的HRP,最后进行显色定位。

17. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 免疫酶组织化学ABC法 A.用免疫酶组织化学ABC法显示甲状腺激素受体β2在大鼠中缝核神经无细胞核中的定位。B.用免疫前血清代替抗甲状腺激素受体β2抗体，所染色结果为阴性。标尺：50um.(YUAN ET AL. brain Research 2000,868:22)

18. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 第二节 在受体定位中原位杂交组织化学的原理和方法 原位杂交组织化学(In Situ hybridization Histochemistry) 是应用带有标记物的已知碱基序列为探针 (Probe) 与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影或免疫组织化学方法在核酸原有的位点进行细胞内定位观察。 原位杂交组织化学是研究受体的mRNA在特定细胞中表达和定位的有力工具。 许多受体有不同的亚型，有些受体亚型在药理学上仅有非常细微的差别。由于不同的亚型由不同的基因编码，检测其相应的mRNA可对不同的受体亚型进行鉴别和定位。

19. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 一 探针 常用的有DNA寡核苷酸探针和酶促合成的RNA探针. DNA寡核苷酸探针设计和合成方法简便,探针序列较短 (一般为30-40 个碱基)，组织穿透性强，但其敏感性低于RNA探针. RNA探针由插入到载体中的cDNA转录而来,在适当条件下，可转录cDNA的完整序列 ,因此RNA探针可耐受非常严格的杂交条件，从而获得强杂交信号及低背景的理想结果.

20. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 标记探针 *最常用的标记物为放射性同位素 3H的分辨力高,能得到良好的细胞定位，但放射自显影时间长，一般需几周或更长 . 32P能量最大,放射自显影时间较短，仅需几天，但分辨力低 . 35S标记的探针做原位杂交，其分辨力不及3H，但明显优于32P，能得到良好的定位，放射自显影时间约10天，比32P长，但比3H短. 35S为目前原位杂交放射性标记物中应用最为广泛的一种同位素 *另一类常见的标记物为地高辛 (Digoxingenin) 地高辛分子可被特异性抗体检测, 方法简便, 无放射性污染问题, 且分辨力比较高。 不足之处在于其敏感性较放射自显影低，且定量较为困难 .

21. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 二 原位杂交组织化学反应 1 放射性标记RNA 探针的原位杂交 *杂交前处理: 杂交前用一系列溶液预处理,目的是通过降低探针与组织切片的静电结合，以减低非特异性背景着色. *杂交反应: 温度一般在37-420C左右 ;过夜杂交; RNA 探针在加入到杂交液之前， 必需加热至800C变性, 反应10 分钟后，速置于冰上. 探针的浓度一般为0.5-5.0μg/ml. *杂交后处理: 包括RNA酶消化及一系列不同浓度不同温度的盐溶液漂洗.

22. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 2 放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交 用寡核苷酸探针进行原位杂交，其严格度可高于RNA探针。原因是寡核苷酸探针较短及 DNA：RNA杂交体的稳定性远低于RNA:RNA杂交体。通常杂交温度为370C，长于36个碱基的寡核苷酸探针杂交温度可提高到420C。杂交温度低，所需的杂交时间要长，通常需过夜。常用探针浓度为0.5μg/ml。 原位杂交组织化学反应的检测方法 放射自显影检测 将杂交后的切片----浸入核乳胶 ----取出凉干----防入暗盒密封---于 40C冰箱内曝光----曝光时间 (32P约需4-7天，3H约需2-3月，35S约需2-4周 )

23. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交 用35S标记的寡核苷酸探针显示谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)的两种不同形式GAD65和GAD67 mRNA在大鼠内侧脚间核(Endopeduncular Nicleus,EP)的分布. GAD65mRNA的表达在EP头侧(A)明显高于EP尾侧(B)。与GAD65相反， GAD67的mRNA表达在EP头侧(C)明显低于EP尾侧(D)。标尺：20um.(Yuan et al. Neuroscience 1997,78:87)

24. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 3地高辛标记的RNA探针的原位杂交 用标准的免疫组织化学检测,连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体与杂交体中的地高辛结合，用硝基蓝四唑(NBT)作为组织化学的底物进行显色. 4 原位杂交组织化学与免疫组织化学双重染色法 双重染色法是先后在同一张切片或相邻切片用原位杂交组织化学和免疫组织化学进行染色，在同一细胞同时显示编码某种受体的mRNA和相应的受体或与其共存的其它蛋白质和多肽。 邻片法可使原位杂交和免疫组化染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。 同一张切片上进行双重染色法可克服这些误差，但第一次染色总要不同程度地影响第二次染色。

25. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 由于mRNA易被染色过程中污染有少量RNA酶的液体所降解，因而实践中往往先进行原位杂交组织化学染色，但对某些较敏感易丢失的蛋白质或生物活性物质，需要先进行免疫组织化学染色，二者须加以平衡考量。 在应用双重染色法中，选用的固定剂除了能保持组织细胞良好的形态结构，还要同时有利于抗原和靶核酸的保留。常用的固定剂为4%多聚甲醛 .

26. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 地高辛标记RNA探针原位杂交与免疫组织化学ABC法双重染色 用地高辛标记探针进行原位杂交，显示 KGFFR mRNA在细胞中的定位。A.用反意义链探针杂交显示 KGFFR mRNA定位于细胞质。B.用有意义链探针杂交，杂交信号明显减少。标尺：50um.(Yuan et al. Gastroenterology 2002,122(Suppl):866)

27. Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science 原位杂交组织化学的对照实验 *已知阳性组织和已知阴性组织做对照 用探针在已知含靶核酸序列的阳性组织和已知不含靶核酸序列的阴性组织标本上进行杂交，应分别得到阳性结果和阴性结果 *用有意义链RNA探针或与靶核酸序列无关的探针做对照 用标记的有意义链RNA探针做原位杂交是证明探针特异性较为理想的阴性对照。有意义链RNA探针的碱基序列与靶mRNA的碱基序列相同，因此，用它做原位杂交应得阴性结果。 *省去标记探针，结果应为阴性 *杂交前用RNA酶处理切片，结果应为阴性 *用Northern和Southern印渍法进一步证实原位杂交结果 *放射自显影检测系统对照 *非放射性原位杂交检测系统对照

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