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Citoplasma. Nucleo. Proteina. Fenotipo. DNA. RNA. Regolazione post-traduzionale. Regolazione trascrizionale. Regolazione post-trascrizionale. Modulazione funzionale. Stabilità. Trasporto. Traduzione. Maturazione. Modificazione. P.C.R. Q-P.C.R. PCR.

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Presentation Transcript
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Citoplasma

Nucleo

Proteina

Fenotipo

DNA

RNA

Regolazione

post-traduzionale

Regolazione

trascrizionale

Regolazione

post-trascrizionale

Modulazione

funzionale

Stabilità

Trasporto

Traduzione

Maturazione

Modificazione

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P.C.R.

Q-P.C.R.

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PCR

  • La PCR è una metodica sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere grosse quantità di materiale genetico a partire da piccole quantità
  • La PCR insieme alla possibilità di sintetizzare comodamente qualsiasi tipo di oligo permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero bersagli molto rari in un genoma complesso: 100mila geni. Un gene tra esoni ed introni puo’ arrivare anche a 2x106 bp ca
  • Una zona specifica di DNA viene bersagliata con due oligo (3’ rivolti l’uno verso l’altro) che amplificano, tramite la reazione polimerasica, la zona stessa copiandola in un enorme numero di volte e rendondola visibile e manipolabile per l’analisi.
  • Si usa una Taq polimerasi
  • Si usa un eccesso di oligo per favorire l’amplificazione fra gli oligo piuttosto che tra il DNA di partenza e il suo oligo
  • Si raggiugne la saturazione della reazione quando ci sarà riassociazione solo fra i prodotti amplificati invece che con gli oligo
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TM = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(G+C)-(600)

N

N

5’ GTCCTACACCTACGAGTGG 3’

3’ GGTGAGCATCCACATCCTG 5’

5’ GTCCTACACCTA

3’ GGTGAGC

Progettazione dell’oligo

  • la % di G e C e la lunghezza dell’oligo influenzano le T. di annealing
  • Evitare la formazione di strutture secondarie:
  • Inter-filamento (dimeri di primer)

Intra-filamento (Hairpin loops)

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Q-PCR

  • La PCR tradizionale ci permette di ottenere informazioni genetiche amplificando il DNA partendo da quantita’ molto basse di copie target
  • La quantità di prodotto finale non e’ in correlazione con il numero di copie terget del DNA specifico di partenza
  • Molte applicazioni in medicina o in ricerca richiedono la quantificazione del numero di copie target del campione di partenza per es:
  • determinazione della carica virale nel sangue per la diagnosi di infezioni di HIV o HCV
  • l’analisi dell’espressione genica da i livelli di mRNA
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PERCHE’ QUANTIFICARE?

  • DNA:
  • alterazioni quantitative, DNA mitocondriale Nel corredo mutato le quantia’ dei geni variano
  • genomi estranei (microorganismi, OGM)
  • DNA fetale (nel sangue materno aumenta nei casi di sofferenza del feto)
  • DNA tumorale (aumenta nei soggetti affetti da neoplasie)
  • mRNA:
  • trascritti virali
  • variazioni temporali
  • variazioni individuali
  • variazioni patologiche
  • trascritti anomali (fusione, splicing)
  • Durante la vita cellulare, sopravvivenza, crescita e differenzazione si riflettono in variazioni di espressione genica. Quantizzare i livelli di espressione genica è un punto determinante nella comprenzione della funzione di un gene
  • La quantificazione di un gene in linee cellulari sottoposte a trattamento farmacologico ci permette di studiarne la sua modulazione

La regolazione dell’espressione genica varia in funzione del soggetto, patologia, sesso ecc.

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Metodi per la misura dei prodotti nella PCR tradizionale

  • PCR radiottiva
  • Ibridazione
  • Primers, sonde, Elisa
  • HPLC
  • ETbr e densitometria
  • Sonde fluorogeniche

Conventional PCR

Real-Time PCR amplification curve

Plateau phase

Ethidium-Gel detection

Log-linear phase

NTC

baseline region

NESSUNO di questi sistemi garantisce la reale quantificazione del prodotto di PCR. Ognuno ha variabili che influenzano e modificano il risultato

La linearita’ della reazione esponenziale della PCR è limitata solo a pochi cicli. L’amplificazione nella fase esponenziale non è rilevabile con i sistemi tradizionali. Per es. con ETbr io rilevo solo il prodotto nella fase di platau.

Le fasi esponenziali sono diverse per amplificati diversi

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Variabili che influenzano la resa della PCR:

  • Estrazione del DNA o RNA
  • Scelta del primer (Tm, strutture del target,omologie interne,contenuto GC/AT)
  • Condizioni di amplificazione (Ta, estenzione, Mg, Taq, ramping, strumento)
  • Variabili imprevedibili (variazioni di T, formazione di aspecifici nei primi cicli)
  • Se facciamo 96 amplificati su piastra i prodotti finali risulteranno tutti diversi
  • Se invece misuro il punto d’inizio dell’amplificazione esponenziale allora il coefficente di variazione sara’ molto basso e i prodotti saranno molto simili

REAL-TIME PCR(o PCR Quantitativa):

Tecnica che permette la quantificazione e l’ identificazione in tempo reale dei prodotti di amplificazione.

La rilevazione dei prodotti di PCR direttamente nella provetta è resa possibile dall’uso di “probe” oligonucleotidici marcati con sostanze fluorescenti

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PCR Convenzionale vs. PCR Real-Time

Problemi con l‘analisi “end-point“ nella PCR tradizionale

Con il progredire della reazione, alcuni reagenti vengono consumati come risultato dell‘amplificazione. Questa deplezione avverrà con velocità differente per ciascuna replica

Divergenza !!!

rilevazione

tradizionale

Rilevazione

Real-Time PCR

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Principio base della Real-Time PCR

Si determina QUANDO viene generato il segnale piuttosto che l‘intensità del segnale stesso (analisi all‘end –point)

Sample

Ct = threshold cycle: Il numero di cicli al quale il prodotto di PCR supera la soglia di rilevabilità

Ct

threshold

non-template

control

baseline region

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log-phase analysis

end-point analysis

N

  • Alta concentrazione
  • Bassa concentrazione
  • N: numero delle molecole amplificate
  • n: numero dei cicli di amplificazione

n

Threshold

unknown sample

La quantificatione nella PCR Real-Time

  • La quantità iniziale di DNA è inversamente proporzionale al numero di cicli necessario per la rivelazione (Ciclo soglia, Ct)
  • Amplificando quantità note dello stesso templato, le quantità ignote si ricavano per interpolazione dalla curva standard.
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Metodi di marcatura e rivelazione fluorescente:

  • Sonde TaqMan
  • Molecular Beacon
  • SYBR Green
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Sonde TaqMan

  • Sonda oligonucleotidica complementare alla sequenza target, interna ai primers di PCR
  • La sonda è marcata con un fluoroforo ad una estremità ed un quencher all’altra

La distanza tra fluoroforo e quencher è tale da bloccare l’emissione di fluorescenza.

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Sonde TaqMan:come funzionano

  • Denaturazione: nessuna fluorescenza
  • Annealing: la sonda lega la sequenza target, ma non si sviluppa fluorescenza
  • Estensione: l’azione dalla polimerasi prima sposta l’ estremità 5’ della sonda, e quindi stacca la molecola reporter mediante l’ attività esonucleasica 5’-3’.Il reporter è libero dal quencher, emette fluorescenza, e si accumula ad ogni ciclo.
  • Lettura della fluorescenza (Plate Read): in qualsiasi fase
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Molecular Beacons

  • Sonda oligonucleotidica a forma di forcina
  • L’ oligo ha un fluoroforo ad una estremità ed un quencher all’ altra

Il loop è complementare alla sequenza target, interna ai primers di PCR

Lo stem è costituito dalle estermità complementari tra loro

In assenza della sequenza target, la sonda rimane chiusa e il quencher blocca l’ emissione del vicino fluoroforo.

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Molecular Beacons: come funzionano

  • Denaturazione: fluorescenza non specifica dovuta a denaturazione della sonda
  • Annealing: si sviluppa fluorescenza solo se la sonda ibrida con il target specifico
  • Estensione: la sonda si dissocia dal target
  • Lettura della fluorescenza (Plate Read): in fase di annealing

Se la sonda è disegnata correttamente, è sufficiente il mismatch di una sola base per impedire l’ ibridazione con il target.

Applicazione: SNP

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SYBR Green

ss DNA

ds DNA

Taq polymerase

SYBR Green

Il SYBR Green si lega al DNA a doppio filamento, in modo non dipendente dalla sequenza.

(si lega ai dimeri di primer, si lega ai prodotti di amplificazione aspecifici)

Il legame al dsDNA determina una forte emissione di fluorescenza (eccitazione 488 nm, emissione 520-530 nm), proporzionale alla quantità di amplificato.

  • Denaturazione: nessuna fluorescenza
  • Annealing: si sviluppa fluorescenza con l’accumulo dell’ amplificato
  • Estensione: si sviluppa fluorescenza con l’accumulo dell’ amplificato
  • Lettura della fluorescenza (Plate Read): in fase di annealing o, di solito, in fase di estensione.
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Q

A

C

FAM

Allelic Discrimination Assay

For Allele 1 - only VIC™ dye signal is generated

VIC

Q

G

C

For Allele 2 - only FAM™ dye signal is generated

FAM

VIC

Q

Q

G

T

A

T

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GENOTYPING

DNA

MUTATON SCREENING

SSCP, HMA, OLA, CC

POPULATION SCREENING

FORENSIC, STR, RAPD, AFLP

PCR

LINKAGE ANALYSIS

MICROSATELLITES

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Ciclo-soglia (CT)

CT

Baseline

La Real-Time PCR:Principio del metodo

Con la Real-Time PCR si determina

“quando” un segnale viene prodotto

piuttosto che rilevarne l’intensità.

Ai comuni reagenti della PCR si

aggiunge un Sonda, specifica per il

gene target, marcata con un elemento

fluorescente che, eccitato da una

sorgente di radiazioni, emette un

segnale solo quando il probe è

appaiato ad una sequenza

complementare.

esecuzione del time course

Universal PCR Master Mix

Sonda Taqman specifica per EDN-1

H2O deionizzata bidistillata

cDNA campione o H2O d.b.

Universal PCR Master Mix

Sonda Taqman specifica per HPRT

H2O deionizzata bidistillata

cDNA campione o H2O d.b.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Controllo

A

B

C

D

E

F

G

H

1h

2h

4h

8h

12h

24h

ntc

60

Esecuzione del Time-Course

Da ognuna di queste miscele sono state prelevate due aliquote da 25 μl e caricate nei pozzetti. A questo punto è stata fatta partire la reazione di polimerizzazione.

risultati
Risultati

I dati ottenuti con la Real-Time PCR sono stati analizzati con il 7300 Software, che utilizza la formula 2 -ΔΔCT:

ΔΔCT= [CT(gene target) – CT(endogeno)]campione - [CT(gene target)– CT(endogeno)]controllo

Abbiamo ottenuto così dei valori

numerici che rappresentano la

variazione di espressione del gene

EDN-1 in cellule HUVEC esposte

a basse dosi di IR.

Poiché per ogni campione sono stati

ottenuti due valori numerici, frutto delle

due repliche sperimentali eseguite,

ed è stata fatta una media aritmetica.

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Appare evidente che viene attivata la trascrizione del gene EDN-1, con un picco di espressione 2h dopo l’irraggiamento delle cellule.

Le medie aritmetiche sono state usate per ottenere un istogramma che rappresenta come varia il livello di trascrizione del gene EDN-1 nel tempo in cellule HUVEC esposte a 10 cGy di Raggi X.

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