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Tema-6. MECANISMOS DE ACCIÓN ENZIMÁTICA. 1.- Efectos energéticos. 2.- Efectos entrópicos. 3.- Efectos de orientación y proximidad. 4.- Efectos del anclaje de los Sustratos sobre la Enzima. Factores responsables de la eficiencia catalítica.

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Presentation Transcript

Tema-6. MECANISMOS DE ACCIÓN ENZIMÁTICA

1.- Efectos energéticos

2.- Efectos entrópicos

3.- Efectos de orientación y proximidad

4.- Efectos del anclaje de los Sustratos sobre la Enzima


Factores responsables de la eficiencia catalítica

* Sabemos que las enzimas actúan estabilizando el estado de transición del complejo-ES, y que esto tiene como consecuencia la disminución de la energía de activación.

G

S#

Reacción sin catalizar

Reacción catalizada

G#nc

S

SC #

G#c

P

G

  • ¿cómo consiguen esto?,

  • Proteínas en solución bajen la G#

  • Factores de incremento de velocidad del orden de 1010 a 1020


Ec. de Eyring:

- Recordemos:

G# = H#-TS#

Entrópia de activación

Entálpia de activación

1.- Efectos energéticos

v = k (ES)

La constante de velocidad, k, puede aumentarse disminuyendo el valor de la energía libre de activación de Gibbs, G#

.

k  aumenta la velocidad de reacción, v v = f(k)


- la disminución de la variación de entalpía de activación, o calor de reacción, H#, conducirá a la disminución de G#=> aumento de la velocidad de reacción.

DG# = DH# - TDS#,

- el aumento de la variación de la entropía de activación, S#, conducirá, también, a la disminución de G‡, => aumento de la velocidad de reacción.

DG# = DH#- TDS#

Todo ello esta de acuerdo con la estabilización del estado de transición en la enzima o por la enzima.

* Las enzimas estabilizan el estado de transición de los sustratos de la reacción por interacciones de sus centros activos con los sustratos en el estado de transición.


Los centros activos de las enzimas, generalmente, están formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.

- En este microambiente apolar la cte. dieléctrica es mucho menor que en un medio acuoso.

Las interacciones electrostáticas entre la Ey el S en el estado de transición, en este ambiente, será mayor, ya que, de acuerdo con la Ley de Coulomb, las fuerzas atractivas o repulsivas son inversamente proporcionales a la constante dieléctrica del medio.

eH2O = 80 eapolar = 2 - 4

F  (1/e)

Esta estabilización por interacciones electrostáticas del centro activo, teniendo en cuenta otros factores, podría explica factores multiplicativos del orden de 108


Lisozima
Lisozima formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.

Glicosidasa hidroliza peptido-glicanos

Interacciones electrostáticas rebajan Energía de estabilización

42,0 a 25kJ/mol velocidad incrementa 103


2 efectos entr picos
2.- Efectos entrópicos formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.

Provocando una ganancia de la entropía DS#

Aumento de la concentración efectiva de sustratos

Reacción intramolecular

ES ES#

A+B C+D Reacción intermolecular

A-R-B C+D Reacción intramolecular

Factor multiplicativo de la velocidad

Velocidad en presencia de catalizador se ha multiplicado por un factor

Concentración de sustrato se hubiese multiplicado por ese factor

Reacciones intramoleculares hay elevadas concentraciones efectivas de sustrato.

Las concentraciones efectivas de substrato se explican en términos de entropía.


Reacción intermolecular la formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.formación del complejo Entropía

A+B C+D Reacción intermolecular

Entropía Translacional (Tres dimensiones del espacio)

Depende de la concentración no de la masa 120-150 J K-1 mol-1

Entropía Rotacional (Molécula )

Depende de la masa del orden 120-150 J K-1 mol-1

Entropia Rotacional (Grupos de la molécula)

Menor contribución 0,4-14 J K-1 mol-1

Entropía vibracional (Átomos de la molécula)

Menor contribución 13-21 J K-1 mol-1

Cuando las moléculas se unen hay una pérdida de de entropía translacional y rotacional

Las reacciones intermoleculares desfavorecidas respecto a reacciones intramoleculares.


Reacción intramolecular formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.: Enzimática

ES ES#

E + S ES

Paso previo formación del complejo ES

Reacción intramolecular

Componente entálpico puede ser negativo, aquí el entrópico es negativo

Calor de reacción que se desprende;

Interacciones no covalentes, electrostáticas, hidrobóbicas, etc

Reacciones enzimáticas tienen lugar en el interior enzimas donde sustratos y residuos de aminoácidos reactivos del centro activo forman parte de un mismo complejo, como una misma molécula

Conclusión: No hay perdidas de grados de libertad Hay ganancia entrópica

Ganancia comparativa en el sentido que no ha habido disminución entrópica


3.- Efectos de orientación y proximidad formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.

El efecto de aproximación tiene en cuenta la aproximación o cercanía de los grupos reactivos.

El efecto de orientación tiene en cuenta la orientación/disposición espacial de las sustancias reaccionantes, es decir de la enzima (centro activo) y del sustrato(s).

Efecto de orientación de los orbitales

Procesos relacionados con la entropía de activación


Efecto de aproximación formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.

v2 = k2()

AB

Supongamos la siguiente reacción intermolecular:

k1 <======>

A + BC

v1 = k1 (A) (B)

Supongamos ahora que la reacción es intramolecular:

k2 <======>

AB

C

k2 > k1, esto es lógico, ya que los grupos reaccionantes están más próximos y por tanto la probabilidad de encontrarse y reaccionar será mayor.

¿Pero cuantas veces puede llegar a ser mayor k2 que k1?


Consideremos la reacción: formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a los sustratos.

k1 A + B C

- En el caso en que [A] >> [B], la reacción que era de segundo orden se transforma en una de pseudo-primer orden

- En estas condiciones, podemos suponer que cada molécula de B está rodeada por moléculas de A  máximo caso favorable de acercamiento

v1 = k1 (A) (B) = kobs (B)

Donde: kobs = k1 (A)

Pero ¿cual es la máxima concentración de A que podemos utilizar?


 Utilizar A como disolvente de B  concentración crítica

k2 = k1 (A)critica

Luego,

kobs = k1 (A)critica

Si ahora suponemos, kobs = k2

De donde deducimos que ….

k2/k1 = (A)critica

Veamos ahora, cuál es la concentración crítica deA, [A]critica, es decir cuanto puede valer.


Supongamos una reacción de hidrólisis un substrato es agua crítica

Mayor concentración de agua en agua es de :

(H2O)critica = 1000 dH2O/PM = (1000 x 1)/18 = 55,55 M

- Lo que nos indica que los efectos de aproximación, como máximo, nos podrían explicar razones k2/k1, del orden de 5 x 101, y que para facilitar calculos podriamos benebolamente redondear a 102.

 que el factor de proximidad solo explicaríaincrementos de hasta102.


+ crítica

El efecto de orientación:orientación/disposición espacial de las sustancias reaccionantes.

Analicemos el siguiente modelo relacionado con la orientación y la aproximación:

No hay reacción  mala orientación


+ crítica

Bien orientado y proximidad adecuada

- Alineados pero no bien orientados

- Bien orientado pero no suficientemente aproximado


Efecto de orientación crítica

C-X

C-X

N:

N-C + X

d-

d+

N:

N-C + X

N:

:N

Supongamos el caso de un ataque nucleofílico:

- No todas las direcciones de acercamiento (o ataque) son igualmente favorables => existen orientaciones preferentes.

Ángulo sólido


A grosso modo El factor multiplicativo lo podemos definir como = 360º/º

Si º = 3,6º, el factor multiplicativo --> 100 (102)  que el factor de orientación solo explicaríaincrementos de hasta 102.

!Aun estamos muy lejos de 1012 -1018¡

* Así pues, teniendo en cuenta los efectos de orientación y de aproximación estaríamos en condiciones de explicar/justificar incrementos de velocidad del orden de .

104

Muy lejos todavía de los valores observados experimentalmente, 108 -1018.


Efecto de orientación de los orbitales como .

El efecto debido a la orientación de los orbitales de los átomos reaccionantes: “Orbital steering effect”.

Koshland, tras el estudio detallado de estos efectos, llegó a la conclusión de que, en el caso de las enzimas, son éstas, las enzimas, las que orientan y aproximan los grupos reactivos, pero que además hay que tener en cuentaun tercer efecto.

Koshland parte de la hipótesis de que, además de los efectos de orientación y aproximación de los grupos reactivos, existe otro efecto, más fino, consistente en la orientación de los orbitales electrónicos de los grupos reaccionantes, permitiendo un solapamiento máximo entre ellos.

Con modelos sacado de la Química Orgánica, Koshland estudió el efecto de aproximación de una serie de reacciones de esterificación intramoleculares.




Reacción intramolecular pero con como menos libertad de giro


Reacción intramolecular pero con como menos libertad de giro


Reacción intramolecular pero con como MENOS libertad de giro


Reacción intramolecular pero con como MENOS libertad de giro


Sustratos libres como

Reacción intramolecular pero con libertad de giro

Idem pero con menos libertad de giro

Idem pero con menos libertad de giro

Idem pero con MENOS libertad de giro

Idem pero con MENOS libertad de giro


- Koshland, observó que la velocidad de reacción era diferente según las posibilidades de giro que tenían los grupos reactivos de la molécula.

- La velocidad de reacción era mayor ( la reacción está favorecida) a medida que disminuía el número de orientaciones posibles,

, es decir a medida que disminuían los grados de libertad.

- Ante estos datos Koshland dedujo que además de los efectos de orientación general y acercamiento, -que están presentes en todas las reacciones intramoleculares- debía haber otro efecto de orientación debido a la limitación de giro de los grupos reaccionantes.

- Todo esto hizo proponer a Koshland la siguiente hipótesis para una reacción enzimática (catalizada por una enzima).


La enzima favorece este tipo de solapamiento, orientando los correspondientes orbitales.

Según Koshland la eficiencia catalítica de las enzimas depende de su habilidad, no sólo para atraer y yuxtaponer los grupos reaccionantes, sino también de orientar los orbitales, de los átomos implicados, de manera tal que el solapamiento es máximo.


Chequeo y critica de la Teoría de Koshland correspondientes orbitales.

O

S

105º

108º

¿Cuánto, cómo de fina ha de ser esta orientación de orbitales?

- Esta orientación orbital es tan fina que basta que haya una pequeña desviación en la orientación de los orbitales, para que el efecto sea mucho menos eficaz, es decir, para que la velocidad de reacción sea mucho menor.

- Para probar esto, se estudió la misma secuencia de reacciones de esterificación anteriormente indicadas, en las que se sustituyó el grupo -OH por un grupo -SH

¿Qué implica esto?


- Comparando las velocidades de reacción de correspondientes orbitales.lactamización con las de tiolactamización, se observa que en todos los casos la velocidad de tiolactamización es significativamente menor, de 102 - 104 veces, dependiendo de cada reacción.


- Así pues, la correspondientes orbitales.orientación de orbitales puede explicar aumentos de velocidad de reacción, hasta del orden de107, que conjuntamente con los efectos de orientacióny aproximación nos permiten justificar valores del orden de …..

1011


*Critica de Bruice correspondientes orbitales.

- La crítica se basa, fundamentalmente, en el calculo del grado de orientación de los orbitales para explicar los órdenes de incremento de velocidad de reacción mayores, p. ej., > 103)

- Según la Teoría de la “orientación de los orbitales”, la orientación debe ser tan fina, que bastaría una desviación de 0,1º para que la reacción no tuviera lugar a esas altas velocidades.

- Esto hace suponer que los orbitales son sumamente rígidos

- Calculando la rigidez de los orbitales, Bruice llegó a la conclusión de que para que se cumpla la Teoría de Koshland los orbitales deberían ser unas 100 veces más rígidos de lo que son, según la propia Teoría de los O. M.


- correspondientes orbitales.La vibración térmica de los orbitales, ya por sí, es de 5º

* Todo lo anterior nos está indicando que la Teoría de Koshlan de la “Orientación de los Orbitales” no es del todo correcta y necesitamos darle algunos retoque o desarrollar otras teorías.


4.- Efectos del anclaje de los Sustratos sobre la Enzima correspondientes orbitales.

Reuben, propuso nueva teoría, la “Teoría del Anchoring” o “Teoría del anclaje”.Reuben. PNAS 68, 563 (1971)

La Teoría de Reuben se basa en el tiempo de colisión de los sustratos que van a reaccionar

-El tiempo de colisión entre dos partículas en solución acuosa es sumamente pequeño, del orden de 10-11 a10-12 segundos.

- Sin embargo, en presencia de una enzima, el tiempo de residencia de los sustratos sobre la enzima, es sensiblemente mayor del orden de 10-4 a 10-7 segundos,.

- Estos valores del tiempo de residencia, pueden utilizarse para explicar el aumento de la velocidad de reacción:


La probabilidad de que tenga lugar la reacción viene dada por:

P = 1 - e-w t

t --> tiempo de choque

w --> una cte que depende de la naturaleza de la reacción

P e 1 - e-we te ------- = -----------------

P 1 - e-w t

- Suponiendo que: i) we = w, ya que el tipo de reacción es el mismo, ii) tc y tnc <<< 1

- Desarrollando en serie los términos exponenciales tenemos

Pc 1 - 1 – we tete ------- = ---------------------- = ------ Pnc 1 - 1 – w tt


-Lo que nos está diciendo que la probabilidad de choque eficiente es proporcional a los tiempos de colisión.

Con otras palabras, la probabilidad de reacción, y por tanto la velocidad de reacción, es directamente proporcional al tiempo de choque o residencia.

Así, para la siguiente reacción: Alcohol-DH Acetona + NADH + H+ <=========> Etanol + NAD+

EnzimaTiempo de residenciaVelocidad de reacción ADH-Higado-buey 3,20 ms 3,5 105 moles s-1 ADH-levadura 0,002 ms 5,0 102 moles s-1

- Estos datos experimentales apoyan la validez de la Teoría del Anchoring o del “Anclaje”.

- Actualmente sabemos, que además de estos factores, también debemos considerar otros, que bien, de una manera independiente, o en sinergia, pueden contribuir a la catálisis.


- Actualmente, se piensa que lo que hace que una reacción enzimática sea tan rápida en comparación con la misma reacción no catalizada, o catalizada por un catalizador químico, es en realidad un compendio de efectos que actúan de manera sinérgica:

  • efectos de proximidad y orientación - efecto de orientación de orbitales - incremento de tiempo de anclaje

ESTABILIZACIÓN COMPLEJO ACTIVADO:

AUMENTANDO S#Y DISMINUYENDO H#


RESUMEN enzimática sea tan rápida en comparación con la misma reacción no catalizada, o catalizada por un catalizador químico, es en realidad un compendio de efectos que actúan de manera sinérgica:

Mecanismo de la acción enzimática se explica por la estabilización del estado de Transición.

Varios efectos coinciden en la acción enzimática.

a) El centro activo de la enzima se encuentra en el interior de la proteína de naturaleza apolar. Tiene como consecuencia que las interacciones electrostáticas entre los residuos de los aminoácidos y los substratos sean más fuerte.

b) El Paso del complejo ES a ES #favorecido entropicamente al ser una reacción intramolecular.

c) Las enzimas se aproximan a los reactantes y posiblemente orienten los orbitales de los grupos que van a reaccionar.

d) Las enzimas aumentan el tiempo de residencia de los subtratos reacionantes faboreciendo la probabilidad de choques eficaces.


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