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FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN

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FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN. Carole Bernard Lorena Gómez Carolina Nuñez Lourdes Sanchez-Cid. INTRODUCCIÓN. Flavodoxin-like domain Descubierto en 1960 en cianobacterias y Clostridium. Presente en proteínas de organismos desde procariotas a eucariotas superiores.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
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FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN

Carole Bernard

Lorena Gómez

Carolina Nuñez

Lourdes Sanchez-Cid

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INTRODUCCIÓN

  • Flavodoxin-like domain
  • Descubierto en 1960 en cianobacterias y Clostridium. Presente en proteínas de organismos desde procariotas a eucariotas superiores.
  • Las proteínas flavodoxinas (compuesta únicamente por el dominio flavodoxina) solo se encuentran en organismos unicelulares (son proteínas altamente ácidas) sin embargo el dominio flavodoxina se encuentra en proteínas multidominio de eucariotas superiores.
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Ninguna flavodoxina ha sido encontrada en eucariotas superiores, pero la habilidad del producto del gen flavodoxina para unir FMN y participar en reacciones de transferencia de electrones parece que ha sido muy útil para organismos superiores que, a través de eventos de fusión génica, lo han incorporado en proteínas multidominio como la reductasa P450, y la sulfito reductasa, donde la secuencia original flavodoxina y el plegamiento pueden ser trazados claramente.

  • Función : unión de flavinas (FMN, FAD) con actividad oxidorreductasa implicadas en el transporte de electrones. (ej: reacciones de fotosíntesis, detoxificación de xenobióticos...)
  • Esenciales para la supervivencia de algunos patógenos humanos  buenas dianas terapéuticas?
slide4

ROSSMAN-FOLD

  • Motivo estructural de proteínas de unión a mono/dinucleótidos : NAD, FAD, FMN.
  • Lámina  compuesta de 5 cadenas  paralelas (core central) envuelta por ambos lados por hélices alfa. Las hélices conservadas son 4 : 2 a cada lado y de larga longitud. Pueden haber otras hélices accesorias.
  • Estructura en 3 capas  /  / .
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“core” central  lámina beta (cinco cadenas betas paralelas)

Hélices alfa (dos largas a cada cara de la lamina beta )

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El centro activo de las flavodoxinas se encuentra según el diagrama de la topología en el “topological switch point” que es donde se une al FMN de cara a su actividad redox

Punto topológico de cambio de orientación

slide7

Anillo isoaloxacina

04

N5

N3

CH3

02

N1

N10

CH3

Cadena

ribitil

P032-

FMN : Mononucleótido de Flavina

slide8

FAD : Dinucleótido de Flavina Adenina

Adenina

Cadena ribitil

Anillo de isoaloxacine

slide9

Comparación de proteínas con plegamiento “flavodoxin-like”de diferentes

SUPERFAMILIAS

slide10

Superfamilias / Familia / Proteína /Especie

  • Flavoproteins / Flavodoxin-related / Flavoprotein / Anabaena
  • SGNH hydrolase / Esterase / Esterase / Streptomyces scabies
  • Succinyl-CoA synthetase domains / Succinyl-CoA synthetase domains / Succinyl-CoA synthetase, alpha-chain, C-terminal domain / Escherichia coli
  • Che Y-like / Che Y-related / Che Y-protein / Thermotoga maritima
  • Toll/Interleukin receptor TIR domain / Toll/Interleukin receptor TIR domain / Toll-like receptor 1, TLR1 / Homo sapiens
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CONCLUSIONES DEL ALINEAMIENTO DE SECUENCIA Y ESTRUCTURAL DE PROTEINAS DE SUPERFAMILIAS DIFERENTES:

NO SE PARECEN EN SECUENCIA

LOW SCORE

RMS ALTO

NO SE PARECEN EN ESTRUCTURA (STAMP)

 ES LO ESPERADO YA QUE LAS PROTEINAS DE SUPERFAMILIAS DIFERENTES COMPARTEN EL TIPO DE PLEGAMIENTO PERO NO SUELEN TENER SIMILARIDAD DE SECUENCIA ENTRE SÍ. ESTAS PROTEÍNAS TAMPOCO COMPARTEN FUNCIÓN Y ALGUNAS NO TIENEN DOMINIO DE UNIÓN PARA EL FMN.

slide15

Comparación de

proteínas con

dominio flavodoxina

de diferentes

FAMILIAS

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Familia / Proteína /Especie

  • Flavodoxin-related / Flavodoxin / Escherichia coli
  • NADPH-cytochrome p450 reductase FAD-binding domain-like /NADPH-cytochrome p450 reductase / Rattus norvegicus
  • Quinone reductase / NAD(P)H:quinone reductase / Homo sapiens
  • Flavoprotein NrdI / Flavoprotein NrdI / Bacillus subtilis
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CONCLUSIONES DEL ALINEAMIENTO DE SECUENCIA Y ESTRUCTURAL DE PROTEINAS DE FAMILIAS DIFERENTES:

  • SE PARECEN POCO EN SECUENCIA (clustalw)
  • RMS MEDIO
  • RMS : +/- 3.14 A
  • DIFIEREN EN ESTRUCTURA PERO TIENEN UNA SUPERPOSICIÓN ACEPTABLE
  • ES LO ESPERADO YA QUE LAS PROTEINAS DE FAMILIAS DIFERENTES NO SUELEN TENER UNA GRAN SIMILARIDAD DE SECUENCIA ENTRE SÍ, PERO COMPARTEN MÁS SIMILARIDAD DE ESTRUCTURA.
  • FUNCIÓN DIFERENTE PERO TODAS TIENEN DOMINIO DE UNIÓN PARA EL FMN O EL FAD.
slide21
Familia “FLAVODOXINA – RELATED”
  • Toda la proteina está formada por un único dominio (dominio flavodoxina)
  • Proteinas de esta familia son perteneceintes a organismos simples unicelulares eucariotas y procariotas
  • Función: intervienen en procesos biológicos de transferencia de electrones
  • Cofactor (FMN) : unen FMN con actividad oxido reductasa, funciona como grupo redox
  • Actúan como mediadores redox en el metabolismo
  • Intercambibles en su mayoría por ferrodoxinas
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 Especialmente importantes en la activación de sistemas enzimáticos donde se requieren donadores de electrones

(reacciones flavodoxinas dependientes)

 Proteinas de transferencia de electrones

FMN coenzima del grupo prostético de varias flavoproteinas oxido-recutasas.

slide24

Familia de Cytochrome p450 reductase N-terminal domain-like

Proteínas multidominio (unión a FAD,FMN,NADH)

  • 1)NADPH-cytochrome p450 reductase, N-terminal domain-like (homo sapiens)
  • Función: proteína donadora de electrones para varias enzimas oxigenasas como el citocromo P450, enzimas involucradas en el metabolismo de muchos fármacos y en la síntesis de hormonas esteroideas. 
  • 2)     Nitric oxide (NO) synthase FMN domain (rattus norvegicus)
  • Función: formación de NO por oxidación de la L-arginina para la señalización y defensa celular. (transfiere electrones)
slide30

Ejemplo:

NITRIC-OXIDE SYNTHASE REDUCTASE

slide34

Flexible hinge (bisagra)

Residuos no cristalizados

slide35

Beta-finger

(Beta-Hairpin)

slide36

FAD

3,38 A

FMN

slide38

En esta posición el FMN esta completamente “sepultado” en la interfase de los dominios impidiendo el flujo de electrones del FMN al aceptor de electrones.

El “flexible hinge” sirve de pivot y le confiere movilidad conformacional al dominio de unión de FMN.

Esta flexibilidad rotacional tiene importantes implicaciones funcionales ya que es la clave del mecanismo de transferencia de electrones

.

familia quinone reductasa
Familia: Quinone reductasa
  • Protein domains:
  • NAD(P)H quinone reductase (QR1)
  • Quinone reductase type 2 (menandione reductase) (QR2)
slide40

QR1 vs. QR2

  • Enzimas citosólicas
  • Expresión en corazón, músculo esquelético, hígado y riñon
  • Función: reducción de compuestos quinólicos para protección celular. Mediante una reducción de 2e-
  • QR1 sobreexpresión en tumores  nuevos quimioterápicos
  • Donador e- en QR1: NADH o NADPH
  • Donador e- en QR2: derivdados nicotinamida no P
slide41

QR2

QR1

slide46

Tyr126 y 128

Vs.

Phe126 y Ile128

slide48

Tyr104

Leu103

3A

172,8º

QR1 Gln

slide49

2.07A

160.2º

Phe106

Trp105

2.705A

167.1º

slide50

Gly150

2.74A

150.9º

Gly149

3.2A

138.3º

slide51

Tyr155

3A

160º

slide52

Thr147

2.7A

144.2º

H?

2.47A

slide53

Asn18

His11

2.7A

112.2º

2.64A

125.4º

slide54

Phe17

3.5A

112.5º

slide55

Arg200

4.47A

135.7º

Glu147

3.9A

148.8º

slide58

Mecanismo de reducción quinones (QR1)

His161

Tyr155

NAD(P)H

H

H

Quinona

H

NAD(P)+

FAD

FADH2

slide59
Histidina 161 muy importante

Sin embargo, no esta conservada en QR2:

His161(aromático)  Asn161(no aromático)

slide61

Asn161

FAD

Tyr155

slide62

Clasificación

Clase Alfa y beta (a/b)

Dominio Flavodoxina: existen 15 superfamilias

Superfamilia Flavoproteínas

“Flavodoxin-related”

Cytocromo P450 reductasa

Quinona reductasa

NADPH-reductasa FMN dep.

Flavoproteina NrdI

Familias

slide63
ANÁLISIS DE:

- Las regiones, residuos y tipo de interacciones que intervienen en la estabilización del FMN en las proteinas de diferentes familias (del dominio flavodoxina)

- si existe o no conservación en estas interacciones en las proteinas de cada familia y entre familias

- Conservación de secuencia(dentro de cada familia)

- Conservación de estructura(dentro de cada familia)

-Encontrar diferiencias entre familias

familia 1 flavodoxin related
Familia 1)“Flavodoxin – related”

Hemos cogido cuatro proteínas flavodoxinas de diferentes especies

-1ahn E. Coli

-2fcr Chondrus crispus

-1fx1 Desulfobrivio vulgaris

-1czn Anacistys nidulans

Toda la proteina es el dominio flavodoxina; pertenecen a organismos simples unicelulares eucariotas y procariotas

slide68

FLAVODOXINA E.Coli

Asp11

Thr12

Ser10

Gly13

Thr15

Asn14

Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato

OH del r O 1,2,3 del grupo P

NH (esqueleto o del r)

PH

slide69

2,69 A

180º

Tyr58

Trp57

Thr56

169º 3,71A

Tyr59

Loop 2 - int. hidrofóbicas

- Thr puente de hidrógeno con la cadena ribitil

FLAVODOXINA E.Coli

slide70

Tyr97

Tyr94

o

Loop 3 - int. hidrofóbicas

- tyr 94 y tyr 97

FLAVODOXINA E.Coli

slide71

Sandwich - 2 trp y tyr en situación paralela estabilizan el anillo isoaloxacina mediante interacciones hidrofóbicas

FLAVODOXINA E.Coli

Tyr94

Trp57

slide73

LOOP 1

LOOP 2

β

α

LOOP 3

FAMILIA “FLAVODOXINA-RELATED”

slide74

LOOP 1

1ahn S D T G N T

2cfr T S T G N T 1fx1 S T T G N T

1czn T Q T G V T

1ahn Y A E Y F

2cfr Y P D N F

1fx1 _ Y E Y F

1czn Y S D N F

1ahn T W Y Y

2cfr T W N T

1fx1 T W G D

1czn T W N V

LOOP 3

LOOP 2

SANDWICH  dos aa hidrofóbicos paralelos estabilizan el anillo isaloxacina mediante interacciones hidrofóbicas. (TIROSIONA Y TRIPTÓFANO)

1ahn Y W 1fx1 W Y

2cfr Y W 1czn W Y

slide75
ALTA CONSERVACIÓN EN LAS REGIONES DE UNIÓN A FMN EN LAS 4 PROTEINAS DE MI FAMILIA

 CONSERVACIÓN DE LOS TRES LOOPS.

- AMINOÁCIDOS SON IDENTICOS

- OTROS VARIAN PERO SON DEL MISMO TIPO Y INTERACCIÓN

 LOOP 1 (REGIÓN DE UNIÓN A PO3) ES LA MÁS INVARIABLE Y CONSERVADA DE TODAS DENTRO DE LAS FLAVODOXINAS. LAS INTERACCIONES CON EL ANILLO TIENEN MÁS VARIABILIDAD.

slide77

CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA

Porcentaje de identidad de secuencia

-menor (29,27%) 2fcr y 1akw

-mayor (45,51%) 1ahn y 1czna Media  37,94%

slide79

RMS  1,30

SCORE  7,88

familia 2 citocromo 450 reductasa n terminal domain like
Familia 2)Citocromo 450 reductasa N-terminal domain like

Hemos cogido dos proteinas

 1b1c humano (solo cristalizado el dominio flavodoxina)

 1tll rata (multidominios)

slide82

Ejemplo:

FMN-BINDING DOMAIN OF HUMAN CYTOCHROME P450 REDUCTASE

slide88

Ser 26

2,5 A

107º

slide89

Gln27

157º

2,68 A

slide90

Thr 28

123º

2,8A

2,5A

slide91

Loop 3aa polares hacen puentes de hidrógeno con el grupo isoaloxacina

Asn 122

Asn 115

His 120

FMN

Gly 81

slide92

FMN

115º

3,80A

3,04 A

150º

Gly81

slide93

FMN

130º

2,96A

3,18 A

115º

Asn115

slide94

FMN

2,87A

129º

His120

slide95

Asn122

2,9A

134º

FMN

slide96

Tyr80

Tyr118

Sandwich 2 aa hidrofóbicos estabilizan el anillo isoaloxacina (interacciones hidrofóbicas) paralelos al anillo

slide99

Oxigeno 3

Oxigeno 4

Asp148

slide100

Oxigeno 3

Oxigeno 4

Asp 147 y 149

Asp148

slide101

¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?

¿Y ENTRE ESTA FAMILIA Y LA ANTERIOR?

slide102

LOOP 1

LOOP 2

LOOP 3

slide103
TRES LOOPS

Loop 1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con el grupo fosfato. Conservación entre proteinas de esta familia y con la familia 1) flavodoxina-related

1ahn S D T G N T

2cfr T S T G N T 1fx1 S T T G N T

1czn T Q T G V T

1b1c S Q T G T A

1tll T E T G K S

Conservación dentro y entre las dos familias

Familia 1

Familia 2

PUENTES DE HIDRÓGENO CON EL GRUPO FOSFATO (PO3)

slide104
Loop 2) treonina que interacciona haciendo puente de hidrógeno con la cadena ribitil y aa hidrofóbico que forman parte del sandwich

1ahn T W Y Y

2cfr T W N T

1fx1 T W G D

1czn T W N V

1b1c T Y

1tll T F

Sandwich

Conservación dentro y entre las dos familias

T hace puente de hidrógeno con O de la cadena ribitil

slide105
Loop 3)aa hidrofóbico que forma el sandwich y aa polares que interaccionan con el anillo isoaloxacina mediante puente de hidrógeno

1ahn Y A E Y F

2cfr Y P D N F

1fx1 _ Y E Y F

1czn Y S D N F

1b1c N K T Y E H F N

1tll S R A Y P H F C

Aa hidrofóbico que forma parte del sandwich

PH con el anillo isoaloxacina

PH con el anillo isoaloxacina

slide106
DIFERENCIAS ENTRE FAMILIA 1 Y 2

AA BASICOS (+)

AA ACIDOS (-)

slide107

FUERTE MOMENTO DIPOLAR

BASICOS +

BASICOS +

>15 A

ACIDOS -

slide108

Distribución de cargas mixtas

Cluster 2

(Aspárticos)

Cluster 1

(Glu + Asp)

Cluster3 (Glu+ Asp)

slide111

CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA

Porcentaje de identidad de secuencia  35,71 %

-

slide113

RMS 1,03

SCORE 7,02

slide114

Familia 3) Quinona reductasa

Hemos cogido dos proteinas

Un único dominio de unión a FAD

 1QR2 humano

 1D4A humano

slide115

EJEMPLO

EJEMPLO  QUINONA REDUCTASA HUMANA TIPO 2

slide117

Asn18

His11

2.7A

112.2º

2.64A

125.4º

Loop 1 y cadena alfa aa polares hacen puente de hidrógeno con el grupo fosfato

slide118

Tyr104

QR2 Gln

Leu103

3A

172,8º

Loop 2) aa hidrofóbicos hacen puente de hidrógeno con el anillo isoaloxacina (cadena principal)

slide119

Loop 2) aa hidrofóbicos hacen puente de hidrógeno con el anillo isoaloxacina (cadena principal)

2.07A

160.2º

Phe106

Trp105

2.705A

167.1º

slide120

Loop 3) aa hacen puentes de hidrógeno con el anillo isoaloxacina

Gly150

2.74A

150.9º

Gly149

3.2A

138.3º

slide123

¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?

¿Y ENTRE ESTA FAMILIA Y LAS DOS ANTERIORES?

slide124

Loop 1

alfa

Loop 2

Loop 3

Loop 4

slide127

CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA

Porcentaje de identidad de secuencia  48,18 %

-

slide129

RMS  0,76

SCORE  7,66

slide130
CONCLUSIONES

 Conservación a nivel de secuencia en las tres familias (identidad 35,71 - 48,18 %)

 Conservación a nivel de estructura en las tres familias

RMS ( 0,76 - 1,30)

“La estructura se conserva más que la secuencia” diferentes tipo de aa dan mismo plegamiento”

slide131

Interacciones de unión a FMN

  • -alta conseración dentro de cada familia
  • -alta conservación entre familias flavodoxina-related y familia citocromo p450 (las dos unen FMN)
  • - NO existe conservación en la familia quinona reductasa con las anteriores.
  • Hipótesis  unión a una flavina diferente FAD
  • - la familia citocromo p450 presenta una conservación de residuos cargados ausente en las demás familias. Hipótesis  importancia de estos residuos en la interacción entre dominios, (proteinas multidominios)
slide133

UPPER LOOP

Trp 90

Gly 91

Gly 89

LOWER LOOP

Glu 59

Asp 58

Met 56

Gly 57

ANILLO ISOALOXAZINA

slide134

TRP 90

MET 56

ANILLO ISOALOXAZINA

slide135

Asn 11

O’4

Ala 55

O’2

CADENA RIBITIL

slide136

O’4

Asn 11

O’2

O’4

Ala 55

3,24Å

150,14º

Asn 11

2,69 Å

135,7º

CADENA RIBITIL

slide137

Gly 10

Thr 9

Asn 11

Gly 8

Thr 12

Ser 7

PO3-

GRUPO FOSFATO

slide138

Asn 11

NO PUENTE H

3,02Å

114,5º

2,7 Å

109,7 ºC

O2

O3

PUENTE H

O3

PUENTE H

2,95 Å

123,5º

Gly 10

O2

2,54Å

146,2º

Ser 7

NO PUENTE H

2,54 Å

146,2º

Thr 12

Gly 8

Thr 9

O3

PO32-

O2

3,83 Å

135,5º

2,93Å

137,3º

PUENTE H

PUENTE H

slide139

Trp 90

Asp 58

Asn 11

Met 56

Gly 57

Gly 57

Asn 11

Met 56

Asp 58

Trp 90

STAMP

slide140

FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

MET 56

C - C - C - N

-72,4

-70,1

S - C - C - C

-60,1

-67,8

C - S - C - C

114,7

-64,7

ÁNGULOS DIEDROS

slide141

ASP 58

FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

C - C - C - N

-159,3

-176,7

O1 - C - C - C

63,5

23,2

O2 - C - C - C

-94,2

-156,9

ÁNGULOS DIEDROS

slide142

TRP 90

FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

C - C - C - N

55,3

51,2

C1 - C - C - C

83,1

79,7

N1 - C1 - C - C

-178,9

179,5

ÁNGULOS DIEDROS

slide143

ASN 11

FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

C - C - C - N

-66,1

-63,6

O1 - C - C - C

-21,4

158,4

N2 - C - C - C

156,2

-22,1

ÁNGULOS DIEDROS

slide145

Asp 58

Gly 57

CONFORMACIÓN TRANS-O-DOWN

FMN OXIDADO

slide146

FMN REDUCIDO

Asp 58

Gly 57

CONFORMACIÓN TRANS-O-UP

slide147

FMN REDUCIDO

FMN OXIDADO

Met 56

Met 56

slide148

Trp 90

Trp 90

FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

125,5º

130,7º

slide149

FMN OXIDADO

FMN REDUCIDO

Asn 11

NO PUENTE H

O’4

Asn 11

2,69A

135,7º

slide150

FMN REDUCIDO

Asn 11

NO PUENTE H

slide156

2 HIDROFÓBICOS FLANQUEAN 2 BÁSICOS Y ÉSTOS A 2 POLARES CENTRALES

CON/SIN LIGANDO

Alternan polares e hidrofóbicos

Todos polares

slide157

Relación estructura-función

El plegamiento del dominio permite la unión de cofactores que son donadores y aceptores de electrones. El FMN además de poder unirse, es estabilizado por la gran cantidad de puentes de hidrógeno y de interacciones hidrofóbicas que puede establecer gracias a la repetitiva presencia de anillos aromáticos. Éstos proporcionan una deslocalización electrónica eficaz, sin la cual no podrían transferir electrones y ejercer así su función de transportadores de éstos.

slide158

Bibliografía

  • Ludwig, M L., (1996) Control of Oxidation-Reduction Potencials in Flavodoin from Clostridium beijerinckii: The Role of Conformation Changes.
  • Frazao, C., Silva G. Structure of a dioxygen reduction enzyme from Desulfovibrio gigas
  • Faig, M., Bianchet. M.A(1999) Structures of recombinant human and mouse NAD(P)H: quinone oxidoreductases: Species comparison and structural changes with substrate and release (1999)
  • Sevrioukova, I.F., Li, H., (1998) Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex
  • Ludwig, M L, Andersen, R.D. (1969) The Structure of a Clostridial Flavodoxin
  • Sibille, N., Blackledge, M., (2005) Solution Structure of the Sulfite Reductase Flavodoxin-like Domain from Escherichia coli
  • Hubbard, P.A., Shen, A.L., (2001) NADPH-Cytochrome P450 Oxidoreductase, structural basis for hybride nd electron transfer
  • Burnett, R.M., Darling, G.D., (1973) Structure of the Oxidized Form of Clostridial Flavodoxin at 1.9A Resolution
  • Foster, C.E., Bianchet, M.A., (1999) Crystal Structure of Human Quinone Reductase Type 2, a Metalloflavoprotein,
  • Grandori, R.,Khalifah, P. (1997) Biochemical Characterization of WrbA, Founding Member of a New Family of Multimeric Flavodoxin-like Proteins.
slide159
PEM

1. Sobre les proteïnes flavodoxines, quines respostes son verdaderes?

a) Les proteïnes flavodoxines no es troben en eucariotes superiors.

b) El domini flavodoxina no es troba en organismes procariotes.

c) Les dos anteriors.

d) Uneixen mononucleòtids d’adenina.

e) Totes les anteriors.

2. Sobre el plegament de Rossman, quines respostes son certes?

a) És un plegament format per 5 làmines β paral·leles (core central) envoltada pels dos costats d’hèlix α.

b) És un motiu estructural de proteïnes d’unió a ATP, ADP i AMP.

c) Les dos anteriors.

d) Té una estructura de 3 capes α/β /α.

e) Totes les anteriors.

3. Senyala la resposta verdadera sobre el FMN:

a) Té un dimetil benzè formant part del anell isoaloxacina.

b) La cadena ribitil és un sucre que uneix l’anell d’isoaloxacina i un grup fosfat.

c) Els N3 i N10 no poden participar en la formació de ponts d’hidrogen.

d) El grup fosfat es troba a uns 8.5 Amstrongs de l’anell d’isoaloxacina.

e) Totes les anteriors.

slide160
4. Senyala les verdaderes:

a) Les proteïnes que comparteixen el plegament Flavodoxin-like presenten sempre un domini d’unió a FMN.

b) Les proteïnes que comparteixen el plegament Flavodoxin-like no tenen per què tenir la mateixa funció.

c) Existeix una similaritat de seqüència acceptable entre les diferents superfamílies.

d) Les proteïnes de famílies diferents sempre tenen un domini d’unió a FMN o FAD i la mateixa funció.

e) Totes les anteriors.

5. En la proteïna Nitric-oxide synthase reductase de la superfamília de les flavoproteïnes,

a) Existeix un connecting domain amb regions específiques amb importants implicacions funcionals.

b) El “flexible hinge” confereix mobilitat al domini d’unió a FMN.

c) Les dos anteriors son certes.

d) Les regions específiques son el β finger (que és un β-propeller) i un “flexible hinge”.

e) Totes les anteriors son certes.

6. En relació amb les proteïnes QR1 i QR2 de la família Quinone reductase,

1) QR1 i QR2 s’uneixen tant a FAD com a FMN.

2) QR1 presenta un domini C-terminal, no present en QR2, important per la unió a NAD(P)H/NADH.

3) QR1 i QR2 son heterodímers.

4) L’alineament de les seves seqüències presenta un 48.18% d’identitat.

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7. L’estabilització del FMN en el domini flavodoxina:

1) Depèn d’unes interaccions hidrofòbiques en sandwich entre dos arginines.

2) Dèpèn de múltiples interaccions amb molècules d’aigua del solvent, al que es troba exposat el FMN.

3) Depèn d’interaccions iòniques amb aminoàcids del loop 2.

4) Depèn d’interaccions de pont d’hidrogen entre aminoàcids polars i els oxígens del grup fosfat.

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8. Sobre els canvis conformacionals que es produeixen quan el FMN està reduït i oxidat, assenyala la/les respostes

certes:

1) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-up donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N3 de l’anell d’isoaloxacina..

2) Quan el FMN està reduït el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-up donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N5 de l’anell d’isoaloxacina.

3) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-down donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N10 de l’anell d’isoaloxacina.

4) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-down.

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9. Quina de les regions que intervenen en l’estabilització del grup FMN de les proteïnes flavodoxines és el més

invariable i conservat? Assenyala la resposta correcta.

a) Regió d’unió al grup fosfat. Loop d’aminoàcids polars que fan ponts d’hidrogen amb els tres oxígens del grup fosfat del FMN.

b) Regió d’unió al anell isoaloxacina. Loop d’aminoàcids polars que fan ponts d’hidrogen amb els oxígens i nitrògens del anell.

c) Estructura en sandwich. Dos aminoàcids paral·lels al anell isoaloxacina l’estabilitzen a través d’interaccions hidrofòbiques.

d) Clusters d’aminoàcids carregats (bàsics i àcids) amb distribució asimètrica.

e) Regió de tres aspàrtics consecutius que interaccionen iònicament amb els oxígens del grup fosfat.

10. En quina família dins de la superfamília flavoproteïna, existeix una conservació de clusters d’aminoàcids

carregats amb distribució asimètrica que provoca que el domini sigui un fort dipol, i les interaccions

electrostàtiques del qual son essencials per la unió d’aquestes proteïnes amb el seu substrat?

1) Flavodoxin-related

2) Flavoprotein NrdI.

3) Quinona reductase

4) Cytocromo P450 reductase

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assaig
ASSAIG

1. ¿Com es produeix el mecanisme de transferència d’electrons en las proteïnes QR1 (NAD(P)H

quinone reductase) i QR2 (quinone reductase type2), i quin tipus de cinètica segueixen?

Resposta:

El mecanisme de transferència d’electrons en aquestes proteïnes es produeix a través d’una cinètica

ping-pong.

En QR1: arriba el NADH, cedeix un protó al FAD, quedant aquest semireduït, i després el NADH es

desprèn de l’enzim. Posteriorment, per estabilitzar-se, el FAD captura un protó de la tirosina 155, la

qual compensa la seva càrrega negativa perquè la histidina 161 li cedeix un protó. En aquest moment el

FAD es troba reduït per complet. Aleshores entra la quinona, i interacciona amb la histidina 161 a

través d’un pont d’hidrogen. El FADH2 li cedeix un protó a la quinona reduint-la, però necessita un

segon protó per reduïr-se completament, i aquest se li cedeix la histidina 161, amb la que estava fent un

pont d’hidrogen. Finalment, la quinona ja reduïda surt del lloc catalític, permetent l’entrada de

molècules d’aigua que reprotonan la histidina 161.

En QR2: al no estar conservada la histidina 161 el mecanisme es diferent. No se sap molt bé, però s’ha

hipotetitzat una possible via de transferència d’electrons a través d’una sèrie d’aminoàcids específics

(histidina173, tirosina132, asparagina161 i tirosina155), l’àtom de zinc endogen i el donador

d’electrons, fins arribar al substrat.

2. Perquè al realitzar un Stamp pot donar un Score i un RMS baixos? Com ho faries per obtenir

un Score alt i un RMS baix?

Al comparar proteïnes de longituds molt diferents, encara que stamp pugui superposar

satisfactòriament un número elevat de residus (RMS baix, bo), com queden molts residus que no poden

superposar-se degut a la diferència de longitud, apareix un Score baix (dolent). Per solucionar el fet

d’obtenir un Score baix i un RMS bó, podem reduir el tamany d’una proteïna tallant el domini que ens

interessa.

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3. Quin tipus de plegament presenten els dominis flavodoxina? Explica tot el que sàpigues sobre aquest

plegament.

El domini flavodoxina presenta en tots els seus casos un plegament “Rossman-fold”.

El plegament Rossman es un motiu estructural de proteïnes d’unió a mono/dinucleòtids (NAD, FAD, FMN).

La seva estructura pertany a la classe alfa/beta (alternança).

Té un plegament tridimensional organitzat en tres capes (alfa/beta/alfa). Les seves estructures secundaries

son una làmina beta central formada per 5 cadenes beta paral·leles que formaria el “core central” envoltada

per els dos costats per hèlix alfa. Les hèlix més conservades son 4, dos hèlix alfa a cada costat, i poden haver

altres hèlix accessòries.

4. Per quin procés evolutiu el domini flavodoxina apareix en proteïnes multidomini en cèl·lules

eucariotes quan en procariotes constitueix la proteïna sencera, i perquè?

Cap flavodoxina ha sigut trobada en eucariotes superiors, però l’habilitat del producte del gen flavodoxina

per unir FMN i participar en reaccions de transferència d’electrons sembla que ha sigut molt útil per

organismes superiors que, a través de processos de fusió gènica, l’han incorporat en proteïnes multidomini

com la reductasa P450, i la sulfit reductasa, on la seqüència original flavodoxina i el plegament poden ser

reconeguts clarament.

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