INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA

1. INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA Sylvia V. Copaja C. Semestre Otoño 2007

2. CROMATOGRAFIA DE GASES MUESTRA VOLATILIZACIÓN La elución se produce por flujo de la fase móvil que se compone de un gas inerte, el gas no interactúa con la muestra, su única función es transportar los analitos a través de la columna Con relación a la fase estacionaria la cromatografía de gases se divide en:

3. Cromatografía gas-sólido (GSC) • Cromatografía gas-líquido (GLC) En la GSC la fase estacionaria es un sólido (polímeros o tamices moleculares) y su principal aplicación es la separación de especies gaseosas de baja masa molar SO2, NOx, CO, CO2, CH4 La GLC se basa en la distribución del analito entre la fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte

4. Cromatografía gas-líquido (GLC) Aún cuando los principios generales son aplicables a esta cromatografía, es necesario tener en cuenta los efectos de presión y temperatura, por esto ocasionalmente se debe utilizar el volumen de retención como parámetro cualitativo VR = tR FC VM = tM FC FC es el flujo o caudal promedio en la columna, el cual no se puede medir directamente, solo se puede determinar a la salida de la columna

5. Tanto VR como VM dependen de la presión promedio de la columna El caudal promedio es : TC (P - PH2O) FC = FM x --------- x ------------- T P Tc es la temperatura de la columna en Kelvin. T es la temperatura ambiente, FM es el caudal medido y P es la presión del gas a la salida de la columna, generalmente presión ambiente

6. Generalmente el flujo se mide con un medidor de pompas de jabón, por esto se incluye la presión del vapor de agua PH2O Se debe utilizar un factor de corrección que considere la caída de presión VoR = jx tR x FC VoM = j x tM x FC

7. J se puede calcular: 3[(Pi/P)2 – 1] J = -------------------- 2[(Pi/P)3 – 1] Otro parámetro es el volumen específico el cual se difine como: VR - VM 273 Vg = --------------- x ------------- W TC

8. W es la masa de la fase estacionaria K 273 Vg = --------------- x ------------- δS TC En que δS es la densidad del líquido de la fase estacionaria

11. INSTRUMENTACIÓN • Gas portador • Los gases utilizados frecuentemente son:He, Ar, N2, H2 • La elección del gas portador estará • determinada por la naturaleza del detector • Con el suministro del gas se encuentran acoplados los reguladores de presión, manómetros y mediddores de flujo

12. Fácilmente disponible y puro • Económico • Adecuado al detector a utilizar • Gas portador y comportamiento de la columna • Se debe elegir entre optimizar la eficiencia de la columna o el tiempo de análisis • En una determinada columna, el gas portador de mayor masa molar generará más platos teóricos

13. El gas portadorcumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. • Un gas portadordebe reunir ciertas condiciones: • Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) • Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa

15. SISTEMAS DE INYECCIÓN Para una mejor eficiencia de la columna, la muestra debe ser de un tamaño adecuado y ser introducida como un tapón, la inyección lenta y/o muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y mala resolución El método más común de inyección es a través de una microjeringa para inyectar muestras líquidas o gaseosas a través de un diafragma o septum de goma o silicona, en una cámara de vaporización situada en la cabeza de la columna.

16. Si las muestras solidas son facilmente vaporisables entonces sus componentes pueden ser analizados por GC. Todas las muestras deben ser inyectadas en el menor tiempo posible, es decir con una evaporacion flash, para esto el inyector debe estar a una temperatura superior a la de la columna

17. Sistemas de inyección • Inyección directa • Inyección de Split • 3. Inyección de Splitless • 4. Inyección on column • La temperatura de la cámara de vaporización debe estar 50oC más alta que el punto de ebullición del componente más volátil de la mezcla de analitos

18. La temperatura del sistema de inyección también juega un rol importante, si la temperatura es muy baja se tendrá una vaporización incompleta. Si la temperatura es demasiado alta puede haber descomposición o cambios en la muestra. • Consideraciones a tener en cuenta • Tamaño de la muestra • Temperatura del sistema de inyección

19. Para conseguir un volumen de muestra pequeño necesario para una columna capilar (alrededor de 0,005 microlitros no se puede emplear inyección directa. Con este objeto se emplea un sistema con divisor de flujo en una relación fija y constante, se puede obtener la relación por medida directa de flujos a una temperatura y presión dada

22. SOPORTE La función básica del soporte es la de "mantener" (sostener, retener) la fase estacionaria. Idealmente debería ser un material inerte que "mantiene" la fase estacionaria sobre su superficie como una película delgada La mayoría de los soportes cromatográficos está hechos de diatomita.

23. Químicamente es casi todo sílice, con algunas impurezas. También se conoce como Tierras Diatomáceas ó Kiselguhr (palabra alemana). Domina el campo de los soportes debido a su estructura, superficie y disponibilidad Hay que tener en cuenta dos cosas a la hora de escoger un soporte: La Estructura, ó Características Físicas (contribuye a la eficiencia de la columna cromatográfica):

24. Tamaño de partícula • Diámetro del poro • Densidad • Área Superficialy • la Química de Superficie ó Características Superficiales (gobierna la participación del soporte en los resultados de la separación). • Grupos silanoles activos • Iones metálicos

25. Además de las características anteriores, la selección del soporte va a depender también de: • la naturaleza de la muestra • la naturaleza de la Fase Líquida • el uso que se le va a dar a la columna: • General • Específico • Precio

26. Podemos resumir que un buen soporte debe reunir las siguientes características: • Elevada Superficie por unidad de volúmen • Estabilidad Térmica • Dureza mecánica suficiente para que pueda resistir los procedimientos de revestimientos y relleno • Inactividad química o de adsorción • Baja resistencia al paso de la fase móvil

27. Estructura porosa con diámetro uniforme igual o inferior a 10 µm por poro • Las partículas deben tener forma homogénea y ser de tamaño uniforme • Es deseable obtener un • compromiso entre la eficiencia (tamaño pequeño de las partículas) y la caída de presión (tamaño grande las partículas) • El diámetro promedio de las partículas se expresa en unidades de malla, correspondiendo número mayores a diámetros menores

28. La eficiencia de la columna en cromatografía de gases aumenta rápidamente cuando disminuye el diámetro de las partículas La regla de Purnell dice que: El diámetro interno de la columna debe ser por lo menos 9 veces mayor que el diámetro de las partículas del soporte sólido

29. La diferencia de presión que se requiere para mantener un determinado caudal de gas portador, varía universalmente con el cuadrado del diámetro de la partícula, por esto ha condicionado el límite inferior del tamaño de las partículas que se utilizan en cromatografía de gases, dado que no es conveniente trabajar con diferencias superiores a los 50 PSI, las partículas del soporte son generalmente 60 a 80 Mesh (250 a 170 µm) o 80 a 100 Mesh (170 a 149 µm)

30. La eliminación ó reducción de los sitios activos de adsorción (también conocido como Desactivación de la Supeficie) de un soporte cromatográfico puede efectuarse de varias maneras: • Remoción por lavado con ácido (NAW ó AW) • Eliminación ó Remoción por reacción del Grupo Silanol • Saturación de la superficie con una fase líquida • Impregnando ó recubriendo con material sólido inerte

32. Efecto del tratamiento en el soporte (Chromosorb P) • no lavado con acido, • 2. lavado con acido, • 3. lavado con acido y dimetilsilanizado • Solutos: • A etanol, • B metil cetona, • C Benceno y • D Ciclohexano • Condiciones: Soporte 60/80 mesh, He 75 mL/min, 1000 C

35. COLUMNAS Es el lugar donde ocurre la separación. Se dice que es el corazón de un cromatógrafo. Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio ó teflón. El relleno puede ser un sólido, ó un líquido recubriendo un sólido

36. En cromatografía de gases hay dos tipos de columnas: Las empacadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares COLUMNAS DE RELLENO Las columnas de relleno se fabrican con tubos de vidrio, acero inoxidable, cobre o teflón con una longitud de 2 a 3 m y DI de 2 a 4 mm. Estos tubos se empaquetan densamente con un material de relleno sólido, finamente dividido y

37. homogéneo que se recubre con una capa delgada 0,05 a 1 mm de la fase estacionaria líquida • Con el objeto de introducirlo en el horno termostatizado los tubos se fabrican en forma helicoidal • Los pasos necesarios para seleccionar adecuadamente una columna son: • Escoger el material de la columna • Tipo de columna a emplear • Dimensiones de la columna • Selección de la fase estacionaria y soporte

38. FASE ESTACIONARIA La selección de una fase estacionaria a emplear es tal vez lo más difícil de efectuar. La fase estacionaria debe tener las características físico-químicas semejantes a la muestra a analizar Las propiedades semejantes en una fase líquida son: a. Baja volatilidad (idealmente, el punto de ebullición del líquido debe ser al menos 100oC mayor que la temperatura de trabajo máxima de la columna

39. b. Estabilidad térmica c. Químicamente inerte Para que una especie tenga un tiempo de residencia razonable en la columna, debe poseer cierto grado de compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria se aplica el principio de que: Lo semejante disuelve a lo semejante Algunas fases estacionarias de uso frecuente En la siguiente tabla se muestra un orden de polaridad creciente para las fases estacionarias más frecuentes

40. F. estacionaria N. comercial T máxima Aplicaciones comunes Polidimetil siloxano OV-1, SE-30 350 Fase no polar de uso general, hidrocarburos aromáticos, drogas, esteroides, PCbs Poili(fenilmetildifenil) OV-3, SE-52 350 Esteres metílicos de siloxano (10% fenil) ácidos grasoso, alcaloides, dorgas, compuestos halogenados Poli/fenilmetil) siloxano OV-17 250 Drogas, esteroides, (50%fenil) pesticidas, glicoles Poli(triifluoropropildimetil) OV-210 200 Aromáticos clorados, siloxano nitroaromáticos, bencenos alquil sustituidos

41. Polietilen glicol Carbowax 20M 250 ácido libre, alcoholes,ésteres, aceites esenciales, glicoles Poli(dicianoalildimetil) OV-275 240 ácidos grasos siloxano poliinsaturados, ácidos libres ácidos de la colofonia, alcoholes

42. Cinco de los líquidos de la tabla son, polidimetil siloxanos los cuales tienen estructura general R R R I I I R----Si----O---Si---O---Si----R I I I R R R Probablemente estos seis líquidos pueden proporcionar separaciones satisfactorias para el 90% o más de las muestras

43. En todos ellos los grupos R son -CH3, originando un líquido relativamente no polar. En los otros polisilixanos indicados en la tabla, se sustituye la fracción de los grupos metilos por grupos funcionales tales como: fenilo, cianopropilo, trifluoropropilo, etc. Estas sustancias aumentan la polaridad de los líquidos. El quinto líquido es el polietilenglicol que tiene estructura

44. HO- CH3- CH2- (O- CH2-)2- OH Las columnas comerciales están disponibles con fases polimerizadas y/o enlazadas El enlace y el entrecruzamiento, tienen por objeto la preparación de una fase estacionaria debido al sangrado en el cual una pequeña cantidad de líquido inmovilizado es arrastrado fuera de la columna durante el proceso de elusión El sangrado se acentúa cuando una columna debe limpiarse para eliminar los contaminantes.

45. Las columnas comerciales están disponibles con fases estacionarias cuyo grosor varía de 0,1 a 0,5 um. El grosor de la película afecta principalmente a las características de retención y a la capacidad de la columna Las películas gruesas se utilizan con analitos muy volátiles, debido a que tales películas retienen más tiempo a los solutos, y así proporcionan un mayor tiempo para que pueda tener lugar la separación, por otra parte, las películas delgadas son útiles para separar especies de baja volatilidad en un tiempo razonable.

47. FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA Al hablar de fase estacionaria líquida entramos en contacto con dos palabras ó términos:Polaridad y Selectividad. Para poder definir y describir el parámetro polaridad en cromatografía, podemos decir que la polaridad de una fase estacionaria líquida se refiere a las interacciones intermoleculares que involucra dipolos permanentes. Selectividad es definida como las diferentes atracciones intermoleculares

48. Varias cualidades ha de reunir un líquido para servir como fase estacionaria: • Viscosidad • Tensión Superficial • Tensión de Vapor • Selectividad respecto a los componentes de la fase móvil • Reversibilidad del Reparto • Estabilidad Térmica

49. Podemos clasificar las columnas según el propósito del proceso cromátografico: • Empacadas • Analítica • Preparativas • Capilares • W.C.O.T. (Wall Coated Open Tubular) • S.C.O.T. (Support Coated Open Tubular

50. COLUMNAS CAPILARES O TUBULARES • Las columnas capilares o capilares abiertas, son de dos tipos básicos: • Capilares de pared recubierta (WOCT) • Capilares de soporte recubierto (SCOT) • Las WOCT son simplemente tubos capilares con pared interna con una fina película de fase estacionaria • En las SOCT la superficie interna del capilar está revestida con una fina capa de soporte.