生物化学实验

1. 生物化学实验 氨基酸的分离鉴定 -------纸层析法 生命科学学院

2. 生命科学学院 一、实验目的 通过对氨基酸的分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析是以滤纸为支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基吸附着的一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使待分离的物质（如氨基酸）在两相间不断分配而使混合物中的成分得到分离。

3. 生命科学学院 层析方法的分类： 按层析原理：吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析 按支持介质：纸层析(PC)、薄层层析(TLC)、柱层析(CC) 按层析压力：LPLC、MPLC、HPLC

4. 分配层析： 生命科学学院 利用不同的物质在两个互不完全相溶的溶液中的分配系数不同而得到分离。 所以分配系数越大的物质，越是停留在固定相；分配系数越小的物质，越是随移动相移动得迅速。 溶质在固定相的浓度Cs 分配系数α= 溶质在流动相的浓度CL

5. 生命科学学院 原点到层析斑点中心的距离 迁移率Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离 Rf 值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某一物质在一定条件下的α值是固定的,因此Rf 值为其特征常数。

6. 生命科学学院 Rf 值的影响因素： 1. 氨基酸的结构: 相似相溶。氨基酸分子极性的大小决定了氨基酸在水和有机溶剂之间的分配情况。氨基酸极性越低，越容易溶于有机溶剂； 2. 溶剂：同一氨基酸在不同溶剂中的Rf值不同； 3. pH值：溶液的pH值影响氨基酸的解离情况，从而影响氨基酸的极性。如酸性氨基酸在酸性溶液中所带净电荷更少，Rf值更大。 4. 温度：温度影响物质的分配系数。 5. 滤纸：需质地均匀、含杂质尽可能少。

7. 生命科学学院 三、试剂和器材 1. 试剂 (1) 展开剂：正丁醇－乙酸－水（4：1：3，V/V) (2) 氨基酸溶液：0.5%的脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、丝氨酸 (Ser)、 亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)溶液及它们的混合液(Mix)。 (3) 显色剂：0.1%水合茚三酮乙醇溶液。 2. 器材 层析缸、毛细管、电吹风、PE手套

8. 四、实验步骤 生命科学学院 1．将配好的层析液(约50-60mL)倒入层析缸中，液高0.3cm-0.4cm，盖紧缸盖（确定密封），放置以饱和层析缸。 2．取层析滤纸一张。在垂直于滤纸的纹路一端距边缘1.5cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号，作为点样位置（共6点），并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。 3．点样：用毛细管吸取样品约1-1.5cm高，将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，用电吹风冷风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过0.5 cm。

9. 生命科学学院 4．扩展：将滤纸直立于层析缸中，点样的一端在下(移动相的液面需低于点样线)。当前沿线到达层析纸2/3处时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用电吹风冷风吹干。 5．显色：用喷雾器均匀喷上0. 1%茚三酮溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。 6．用铅笔画出层析斑点并计算Rf值。

10. 生命科学学院 五、注意事项 1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，应在操作时带手套。 2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要 热风吹干滤纸。 3. 实验报告中一定要写结果分析，即分析每种氨基酸Rf大小的原因。

11. 生命科学学院 六、思考题 1、请对试验中所用的几种氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。 2、若增加固定相的pH，本实验分离的几种氨基酸的Rf值将如何变化？