XBP1 调控胶质瘤细胞氧化应激的实验研究

XBP1调控胶质瘤细胞氧化应激的实验研究 刘耀华赵世光陈晓丰梁元郑秉杰哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科

ROS

Catalase SOD The Achilles’ Heel of cancer cells(Cancer Cell. 2008;14(6):427-9IF 24.962) Exogenous ROS: The last straw breaks the camel's back. Cancer Cell 14, December 9, 2008

研究背景 活性氧（ROS）与胶质瘤 • 肿瘤，包括胶质瘤可以产生高水平活性氧； • 肿瘤细胞的Akt过度激活，决定了其对活性氧敏感; • 大量活性氧可以杀伤肿瘤，很多化疗药物为活性氧诱导剂; • 调控胶质瘤细胞氧化应激水平可能对其治疗具有积极意义。

研究背景：内质网应激、氧化应激、XBP1 XBP1 XBP1 Hypoxia ROS Nutrients Deprivation Oxidative Stress ER Stress ? Protective molecules

NF-Y NF-Y NF-Y transcripts transcripts transcripts XBP1 XBP1 antioxidant genes (Catalase, SOD1, etc) CCAAT CCAAT ? target genes ERSE transcripts transcripts transcripts

实验设计 • 胶质瘤细胞系U251MG进行RNA干扰，抑制XBP1基因表达后比较细胞对外源性活性氧H2O2的敏感性； • 流式细胞技术检测ROS蓄积和线粒体膜电位； • 检测比较细胞内抗氧化分子表达水平； • 将细胞进行XBP1基因过表达，观察能否起到相反的效果； • 应用启动子突变分析探讨XBP1促抗氧化分子转录活性的机制。

实验结果一 * ** ** 对H2O2的敏感性比较 H2O2处理后trypan blue检测细胞生存情况 *P<0.05, **P<0.01

实验结果一 -C H2O2-0.5 H2O2-0.5 -C 7.1 3 3 3 3 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H 29.4 29.4 60.3 5.4 对H2O2的敏感性比较 Random SiXBP1 13.0 流式细胞技术检测线粒体膜电位（MMP）

实验结果二 * ** ** 抑制XBP1特异性增强细胞对氧化应激的敏感性对活性氧诱导剂PTL的敏感性比较（*P<0.05, **P<0.01)

实验结果二 抑制XBP1特异性增强细胞对氧化应激的敏感性 VP16 FK228 对其它2种化疗药物诱导的细胞死亡没有明显区别

实验结果二 Random-C.001 Random-PTL-20 Random-FK228 Random-VP16 26.9 23.5 21.3 15.2 6.7 41.5 9.0 28.6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H FL1-H SiXBP1-C SiXBP1-PTL-20 SiXBP1-FK228 SiXBP1-VP16 XBP1缺失特异性增强细胞对氧化应激的敏感性 C PTL FK228 VP16

实验结果三 C 3h ** * C * 3h 0 0 1 1 2 2 10 10 10 10 10 10 FL1-H FL1-H 抑制XBP1细胞内活性氧（ROS）明显增高 Random (4.6) 12.1 SiXBP1 (3.8) 24.9 DCFH-DA孵育细胞，流式细胞技术检测细胞内ROS堆积： *P<0.05, **P<0.01

实验结果三 H2O2 Random SiXBP1 C 1h 2h 3h 4h C 1h 2h 3h 4h P-JNK JNK-1 P-P38 P38 Random SiXBP1 PTL C 1h 2h 4h 6h C 1h 2h 4h 6h P-P38 P38 抑制XBP1细胞内活性氧（ROS）明显增高

实验结果四 Random XBP1 Catalase SOD1 ** TRX1 GPX GAPDH XBP1与细胞抗氧化分子的表达抑制XBP1后细胞中抗氧化分子的mRNA水平 (**P<0.01)

实验结果四 XBP1与细胞抗氧化分子的表达 Random SiXBP1 C 1h 2h3h C 1h 2h 3h Catalase SOD1 TRX1 GAPDH Random SiXBP1 H2O2处理细胞后未见Catalase、SOD1和TRX1表达变化 C 3h 6h 9h C 3h 6h 9h Catalase 14-3-3

实验结果四 AT-H2O2.018 H2O2 C AT 0.9 0.9 M1 M1 M1 M1 **P<0.01 0 0 0 0 200 200 200 200 400 400 400 400 600 600 600 600 FL2-A FL2-A FL2-A FL2-A 17.0% 62% AT H2O2 C 1h 2h 3h C 1h 2h 3h PP38 P38 XBP1与细胞抗氧化分子的表达 Catalase特异性抑制剂AT预处理的影响

实验结果五 P<0.01 ** XBP1可增强Catalase转录活性 U251 XBP1过表达 H2O2 mock XBP1 Catalase SOD1 b-actin XBP1

实验结果六 *P<0.05 **P<0.01 XBP1可增强Catalase转录活性荧光素酶（luciferase）活性分析

实验结果六 **P<0.01 **P<0.01 **P<0.01 XBP1可增强Catalase转录活性 Catalase启动子突变

实验结果七 XBP1促进NF-Y与Catalase启动子结合凝胶电泳迁移分析（EMSA）

实验结果七 XBP1促进NF-Y与Catalase启动子结合染色质免疫沉降

小结

Oxidative stress NF-Y NF-Y XBP1 XBP1 XBP1 transcripts transcripts transcripts ROS ROS Oxidative stress ROS Oxidative stress Catalase Catalase Catalase Cell Death Catalase gene CCAAT CCAAT

XBP1 调控胶质瘤细胞氧化应激的实验研究