Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc

1. http://www.ueb.cas.cz/olomouc1 Analýza a třídění chromozomů Pavlína Kovářová Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc

2. Průtokový cytometr Analýza: • Mikrospóry • Protoplasty • Buněčná jádra • Chromozómy • Chloroplasty BD FACSVantage (2 lasery, 8 parametrů)

3. Průtoková komora Elektrický pulz Vzorek Unášecí tekutina . . . . . . . Regulátor tlaku . . - + Vychylovací destička Vychylovací destička Sběrná zkumavka Schéma průtokového cytometru Laser

4. Detektor Laser Vychylovací destička Vychylovací destička Do leva tříděné kapky Do prava tříděné kapky Odpad Princip třídění • Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl • Společná analýza osmi parametrů • Rychlost třídění(102 – 104 chr./ sec)

5. Příprava suspenze chromozomů • Materiál používaný k přípravě suspenze chromozomů: • Buněčné kultury • Protoplasty listového mezofylu • Meristemy kořených špičky Extrakce chromozomů Příprava Buněčná synchronizace Akumulace v metafázi Barvení chromozomů Cytometrická analýza Třídění chromozomů

6. Idiogram Idiogram Frekvence Teoretický flow karyotyp Relativní obsah DNA Flow karyotyp Flow karyotypvyjadřuje závislost relativního obsahu DNA na počtu daného typu chromozomů Detekce strukturálních a početních změn chromozomů v karyotypu

7. Flow karyotyp Chinese Spring 3B III I II Relativvní frekvence 3B Relativní intenzita fluorescence I: 1D, 4D, 6D; II: 1A, 3A, 6A,2D,3D, 5D, 7D; III: 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 2B,4B, 5B, 6B, 7B Hexaploidní pšenice (1C = 17 000 Mbp) Identifikace a určení čistoty tříděné frakce : FISH PRINS PCR Vrana et al. (2001)

8. Diskriminace jednotlivých chromozomů Použití chromozomových linií : • Translokační linie • Deleční linie • Adiční linie Specifické chromozomové barvení • AT a GC nukletidových bazí

9. „Cappelle Desprez“ „Jubilar“ I III I 4AL·4AS-5BL 5BL·7BL III II II Relativní frekvence Relativní frekvence 4AL·4AS-5BL 3B 3B Relativní intenzita fluorescence Relativní intenzita fluorescence Kubalakova et al. (2002) Třídění translokačních linií u pšenice 5BL·7BL Kromě chromozomu 3B je v histogramu oddělený pík pro translokační chromozomy 5BL·7BL a 4AL·4AS-5BL, které můžeme snadno třídit.Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem.

10. Kubalakova et al. (2002) Třídění chromozomových ramen u pšenice „Chinese Spring“ Dt1BS „Chinese Spring“ iso5BL 1BS iso5BL I I III III 1BS II II Relativní frekvence Relativní frekvence 3B 3B iso5BL Relativní intenzita fluorescence Relativní intenzita fluorescence Jednotlivá ramena chromozomů můžeme třídit z ditelosomockych linií nebo z linií nesoucích izochromozomy. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem

11. Secale cereale „Selgo“ T. aestivum (21'' + 1'' 6R) III 1R - 6R 6R 5BL·7BL I II Relativní frekvence Relativní frekvence 6R 3B Relativní intenzita fluorescence Relativní intenzita fluorescence Adiční linie pšenice a žita Jednotlivé chromozomy žita mohou být tříděny z adiční linie pšenice–žito. Tříděné žitné chromozomy jsou identifikoványFISH spSc119.2 repeticíaGAA mikrosatelitem. Kubalakova et al. (2003)

12. Detekce vzácných strukturálních změn genomu Secale cereale „Adams“ Translokace BS·BL-1RS 2R - 7R B DAPI 5S 45S Afa 45S B Relativní frekvence 119 Afa 1R Tato translokace byla detekována u 0.5% tříděných B chromozomů Relativní intenzita fluorescence Průtoková cytometrie umožňuje analýzu velkého množství chromozomů (<103) a tím detekci vzácných strukturálních změn. Kubalakova et al. (2003)

13. 17 μm (1x) PI BAC9 1352 µm (79.5x) Chromosome 3B (T. aestivum) 42 µm “High-resolution” FISH na natažených chromozomech Tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100 xvětší délku, než byla ta původní, čímž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády. Valarik et al. (v tisku)

14. 4 3 5 1 Standartní karyotyp Translokace 6 2 PCR IV III I I II II Třídění 1 2 3 4 5 6 Gelová elektroforeza Fyzické mapování pomocí PCR se specifických primerů Třídění 102 chromozomů trvá jen několik minut, proto je PCR velmi výhodným nástrojem k fyzickému mapování.

15. Konstrukce chromozomově specifických BAC knihoven Chinese Spring I III Kolonie Ligace do defosforylovaného BAC vektoru II 3B Uspořádání na 384-jamkové destičky Cytometrická analýza a třídění E. coli transformace l 3 S 1 2 • 3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice: • 3B chromosomově-specifická BAC knihovna • 1D, 4D, 6D subgenomicka BAC knihovna • BAC knihovna specifická pro chromozomové rameno 1BS kbp - 2200 - 825 Izolace vysokomolekulárni DNA - 225 - 50 Šafář et al. (přijato do tisku); Janda et al. (v přípravě)

16. Fyzické mapování BAC klonů na tříděné chromozomy V BAC knihovně hledáme specifické klony, které mapujeme na mitotických chromozomech pomocí in situ hybridizace. Vysoce repetitivní BAC Tříděné 3B chromozomy 63C11 63B13 63N2 81B7 Filtrpo hybridizaci s genomickou DNA BAC DAPI Málo repetitivní BAC

17. Závěr • Průtoková cytometrie může být použita ke třídění mitotických chromozomů zemědělsky významných obilovin a leguminóz. • Flow karyotyping je vhodný ke kvantitavní detekci numerických a strukturálních změn chromozomů • Tříděné chromozómy jsou vhodné pro fyzické mapování použitím FISH, PRINS and PCR • Tříděné chromozomy lze využít ke konstrukci chromozomově specifických BAC knihoven

18. http://www.ueb.cas.cz/olomouc1 Naše laboratoř