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Moderne tecniche diagnostiche: dall’ematossilina-eosina alla proteomica

CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E DURI DEL CAVO ORALE. Moderne tecniche diagnostiche: dall’ematossilina-eosina alla proteomica. Prof. Lorenzo Lo Muzio. Roma 2-4 dicembre 2004. Evoluzione della patologia. Virchow: Basi cellulari delle malattie.

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Moderne tecniche diagnostiche: dall’ematossilina-eosina alla proteomica

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  1. CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E DURI DEL CAVO ORALE Moderne tecniche diagnostiche: dall’ematossilina-eosina alla proteomica Prof. Lorenzo Lo Muzio Roma 2-4 dicembre 2004

  2. Evoluzione della patologia Virchow: Basi cellulari delle malattie Debebele & Forsson: Primo microscopio Genoma umano PCR ? 1621 1660 1800 1940 1980 1990 2000 Primo paper su immunoistochimica Microarray Malpighi: Microcircolo capillare Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7

  3. Microarray and histopathological analysis of tumours: The future and the past? Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7

  4. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology Part I: Molecular methods Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:650-9 Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

  5. Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. “Histopathology remains at the core of disease diagnosis…..” “……Don’t ask me to run a gel electrophoresis or extract DNA from a specimen and amplify it by polimerase chain reaction….” Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:589-90

  6. Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. “Working together (surgical pathologists and molecular scientist), molecular tools can be applied to practical problems to better understand disease mechanisms and improve diagnostic skills, ultimately aiding in the development of rational therapeutic regimens…..” Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:589-90

  7. La biopsia diagnostica quando e perché? • Definizione etiologica • Patogenesi • Terapia mirata • Prognosi

  8. Identificazione di componenti in cito-istopatologia Strutture identificabili • Membrana e parete • Antigeni parietali / capsulari / somatici / nucleici • Acidi nucleici (DNA / RNA) • Strutture citoplasmatiche • Recettori

  9. Possibili metodiche istologiche e su tessuti microscopia ottica • ematossilina ed eosina • colorazioni speciali • immunocito-istochimica • immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

  10. Possibili metodiche istologiche e su tessuti Esame morfologico (su preparati citologici o bioptici): alterazioni citopatiche nucleo-citoplasmatiche presenza strutture esogene Immunoistochimica/immunofluorescenza: antigeni di membrana/citoplasmatici/nucleari (anche in assenza di evidenti manifestazioni cliniche e/o di alterazioni citomorfologiche) Ibridazione molecolare: in situ estrattiva (priva di dettagli morfologici)

  11. Possibili metodiche istologiche e su tessuti microscopia ottica • ematossilina ed eosina • colorazioni speciali • immunocito-istochimica • immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

  12. microscopia ottica • colorazioni speciali • Van Gieson (collageno) • Colorazione tricromica (collageno, fibre muscolari) • impregnazione argentica (reticolina – collag tipo III, membrana basale – collag IV) • acido Periodico di Schiff (membrana basale – collageno tipo IV, carboidrati….) • Ematossilina di Verhoeff (elastina) • Resorcina (elastina) • Fucsina (elastina) • Orceina (elastina) • Metodo di Feulgen (DNA nucleare) • Rosso Congo (amiloide) • Metodo argentico di Masson-Fontana (melanina…) • Sudan (lipidi) • Argento-Metenamina di Jones (membrana basale glomerulare)

  13. microscopia ottica • colorazioni speciali per microrganismi • Gram • Ziehl-Neelsen Giemsa • metodo di Wade-Fite (lebbra) • metodo argentico di Grocott (miceti e Pneumocystis) • acido Periodico di Schiff (miceti, protozoi, elminti….) • Giemsa (protozoi, elminti….) • metodi di Dieterle o Warthin - Starry (spirochete e legionelle) • orceina di Shikata (HBV) • colorazione di Lugol • Argento-Metenamina di Gomori

  14. Immunoistochimica Prevede il legame di anticorpi primari specifici con l’antigene, l’anticorpo o con il complesso antigene-anticorpo da ricercare. La positività del test è evidenziato dall’impiego di un anticorpo secondario coniugato con un cromogeno Cromogeno Anticorpo secondario Complesso Anticorpo primario – secondario – cromogeno Anticorpo primario Cellula target

  15. Standardizzazione della tecnica • fissazione in formalina tamponata neutra (soluzioni acide riducono l’antigenicità tissutale) • fissazione immediata • processazione del campione fissato entro 24-48 ore • sezioni di 4-5 micron • smascheramento dell’antigene • amplificazione dell’antigene

  16. Smascheramento antigenico La fissazione in paraffina provoca: • legami proteine-proteine • legami proteine-acidi nucleici • legami con ioni calcio con mascheramento o danneggiamento degli epitopi a causa dell’alterazione tridimensionale delle proteine Smascheramento antigenico: digestione enzimatica (soluzione di proteasi, tripsina o pepsina), bollitura, forno a microonde….

  17. Amplificazione antigenica Coniugazione o attacco di un marker enzimatico ad un anticorpo secondario e formazione di un complesso terziario: • Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC) • Perossidasi-anti-perossidasi (PAP) • Fosfatasi Alcalina/anti-Fosfatasi Alcalina (APAAP) • Envision (Polymer detection) Cromogeno Anticorpo secondario Complesso Anticorpo primario – secondario – cromogeno Anticorpo primario Cellula target

  18. Vantaggi • uso di sezioni tissutali routinarie • sistema sensibile (bassi livelli di antigene) • sistema specifico (dipende da specificità dell’anticorpo) Svantaggi • stesso antigene presente in diverse patologie/neoplasie • reazione con diversi antigeni • no utile per differenziare lesioni benigne e maligne • uso di più anticorpi per identificare un tipo specifico di lesione/neoplasia • soggettività della valutazione per molti antigeni • necessità di controlli positivi e negativi • molti anticorpi funzionano solo su sezioni congelate

  19. Identificazione cellulare

  20. Antigeni associati ai tumori

  21. Profilo immunoistochimico delle metastasi epiteliali Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

  22. Possibili metodiche istologiche e su tessuti microscopia ottica • ematossilina ed eosina • colorazioni speciali • immunocito-istochimica • immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

  23. L’immunofluorescenza Fluorocromo Introdotta nel 1941 da Coons et al. è basata sul legame chimico tra il fluorocromo e l’anticorpo. La positività del test è riconducibile all’intensità della colorazione. Complesso Auto Ab Anti-Auto Ab Fluorocromo Anti-Auto Ab Auto Ab Cellula target Immunofluorescenza diretta Coons AH, Creech HJ, Jones RN Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47:200-2.

  24. Immunofluorescenza IgG anti-umane marcate con fluorescina (FITC) + Siero del paziente (con autoAb) Tessuto di controllo Biopsia del paziente (auto Ab in tessuto) + + IF DIRETTA IF INDIRETTA

  25. Applicazioni dell’immunofluorescenza diretta • identificazione di anticorpi o altre proteine flogistiche in patologie autoimmunitarie (IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogeno) • identificazione di antigeni esogeni (virus….) • identificazione di antigeni o componenti della cellula

  26. Immunofluorescenza in lesioni orali

  27. IF IHC Vantaggi e svantaggi Ep Laminina 5: immunoistochimica ed immunofluorescenza

  28. Possibili metodiche istologiche e su tessuti microscopia ottica • ematossilina ed eosina • colorazioni speciali • immunocito-istochimica • immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare

  29. Microscopia confocale laser • Introdotto negli anni 80 permette di ottenere: • immagini prive di fluorescenze dovute a strutture non poste sul piano focale • maggiori dettagli delle cellule • ricostruzione 3D delle immagini. Testa dello scanner Digital Imaging System Sorgente laser Monitor Monitor Obiettivo White JG, AmosWBand FordhamM. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. Journal of Cell Biology 1987; 105: 41–48. Preparato

  30. Possibili metodiche istologiche e su tessuti microscopia ottica • ematossilina ed eosina • colorazioni speciali • immunocito-istochimica • immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare

  31. Possibili metodiche istologiche e su tessuti microscopia ottica • ematossilina ed eosina • colorazioni speciali • immunocito-istochimica • immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

  32. Ibridazione molecolare • In situ: • Isotopica • Cromogenica (C.I.S.H.) • Fluorescente (F.I.S.H.) • Estrattiva: • Dot blotting • Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)

  33. Ibridazione molecolare In situ Fissazione L'ibridazione in situ rivela acidi nucleici in campioni cito-istologici morfologicamente preservati. La tecnica prevede la formazione di ibridi di acidi nucleici costituiti da DNA endogeno a catena unica (denaturata) o mRNA e da una sequenza complementare di acidi nucleici esogeni a singola catena marcata con radioisotopo, con tracciante fluorescente (FISH) o con cromogeni osservabili in microscopia ottica (CISH). Denaturazione Ibridizzazione Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64:600-4. John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223:582-7.

  34. Ibridazione molecolare - In situ • Applicazioni cliniche • Identificazione di • DNA o RNA estraneo • (virus, funghi, batteri e parassiti coltivabili con difficoltà o non coltivabili in vitro - es.: HPV e Pneumocystis carinii) • La metodica, inoltre, consente la definizione specifica di tipo e ceppo. • Alterazioni del DNA cellulare • (amplificazione genica, traslocazioni…) • Mutazioni geniche • Espressione corretta o alterata di RNA cellulare (prodotti genici)

  35. Ibridazione molecolare FISH La FISH (Fluorescence in situ hybridization) è usata per mappare i geni sui cromosomi e caratterizzare le anomalie cromosomiche: una sonda di DNA, marcata con biotina e specifica per un segmento cromosomico o un intero cromosoma (metafase) è ibridizzata ai cromosomi. Dopo il lavaggio si evidenzia la marcatura incubando con un anticorpo anti-biotina marcato con fluorocromo. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64:600-4. John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223:582-7.

  36. Ibridazione molecolare FISH • La FISH può essere usata per determinare: • Delezioni cromosomiche • Traslocazioni • Riarrangiamenti • Amplificazioni Glassman AB. Cytogenetics, in situ hybridization and molecular approaches in the diagnosis of cancer. Ann Clin Lab Sci 1998;28:324-30. Okami K et al. Cyclin D1 amplification is independent of p 16 inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1999;18:3541-5.

  37. Ibridazione molecolare Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

  38. SOUTHERN BLOT per DNA • (Dr. Edward Southern, 1975) • Taglio con enzimi di restrizione (frammentazione riproducibile del DNA) • Separazione dei frammenti di restrizione tramite elettroforesi su gel • Denaturazione del DNA e trasferimento (blotting) dal gel ad un substrato solido (filtro di nylon o nitrocellulosa) • Incubazione del filtro con con una sonda molecolare specifica, marcata con radioisotopo • Evidenziazione dei frammenti ibridizzati con la sonda tramite autoradiografia. 1 4 5 3 2 8 6 7 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:503-17.

  39. NORTHERN BLOT per RNA • Linearizzazione delle molecole di RNA in agente denaturante (formaldeide) • Separazione del RNA tramite gel elettroforesi • Trasferimento su filtro di nitrocellulosa • Incubazione con una sonda marcata • Autoradiografia. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. PNAS 1977;74:5350-4.

  40. WESTERN BLOT per proteine • Separazione di molecole proteiche in base al peso molecolare (estensione dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide) • Trasferimento dal gel a filtro di nitrocellulosa • Incubazione con anticorpo specifico per la proteina in esame • Visualizzazione del complesso antigene (proteina)/anticorpo legato alla proteina con sistema anti-immunoglobulina biotinilata e successiva rivelazione cromogena

  41. Ibridazione molecolare Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

  42. Polymerase Chain Reaction • (P.C.R.) Procedura elaborata da Kary Mullis (premio Nobel) nel 1985. Metodica di amplificazione sequenziale ed evidenziazione del DNA (qualora presente in esiguo numero di copie) che permette di ottenere una quantità di acido nucleico misurabile e caratterizzabile.

  43. Sequenza target Sequenza target Aggiunta Primers Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Riscaldamento Denaturazione Ciclo 1° Raffreddamento • Denaturazione delle doppie eliche di DNA • Incubazione con due primers (oligonucleotidi, 20 basi) che corrispondano alle estremità del tratto di DNA che si vuole amplificare (primer di avvio e di stop) • Aggiunta di nucleotidi e DNA-polimerasi termostabile. • Sequenza di cicli di riscaldamento (denaturazione, copiatura ed estensione della sequenza) e raffreddamento (accoppiamento della catena neo-sintetizzata con quella originaria/stampo) • Ripetizione per un numero di cicli sufficienti ad ottenere un numero di copie identificabili (2 copie) Riassociazione Primers P P DNA polimerasi, Nucleotidi Allungamento primers P P P Riscaldamento Ciclo 2° Raffreddamento P P (4 copie) P P Riscaldamento Raffreddamento P P Ciclo 3° P P (8 copie) P P P P

  44. Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) • Semplificata ed impiegata su vasta scala dall’avvento di apparecchi che effettuano automaticamente i cicli di denaturazione/ copiatura a temperature variabili (DNA Thermal Cycler) • Per scopi diagnostici, consente di individuare ancheuna singola copia di acido nucleico • Nuove tecniche derivate: RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, In situ PCR, Quantitative PCR

  45. Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Applicazioni MICROBIOLOGIAL’uso della PCR ha rivoluzionato la diagnosi e lo studio delle patologie ad etiologia infettiva: la PCR ha risolto molti problemi connessi alle tecniche diagnostiche tradizionali (microscopia ottica, colture cellulari…) e l’individuazione di DNA o RNA appartenente all’agente biologico permette una diagnosi sicura e veloce. L’esame di materiale di archivio ha permesso di stabilire il ruolo di alcuni agenti infettivi in molte neoplasie (HPV e ca della cervice uterina, Epstein-Barr virus e neoplasie post-trapianto, Human Herpesvirus 8 e sarcoma di Kaposi) Schneider A et al. Screening for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia and cancer by testing for high-risk HPV, routine cytology or colposcopy. Int J Cancer 2000;89:529-34. Marchioli CC et al. Prevalence of human herpesvirus 8 DNA sequences in several patient populations. J Clin Microbiol 1996;34:2635-8. Mathis A et al. Simplified sample processing combined with a sensitive one-tube nested PCR assay for detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35:1691-5. Honda J et al. Clinical use of capillary PCR to diagnose Mycoplasma pneumonia. J Clin Microbiol 2000;38:1382-4.

  46. Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) GENETICA La PCR è utile nell’identificazione di disordini cromosomiali e patologie ereditarie, come la fibrosi cistica, la malattia di Gaucher, il deficit della alfa-1-antitripsina, l’emofilia, la trisomia 21, la sindrome di Turner, la NBCCS. Thomas MR et al. The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation. Prenat Diagn 1995;15:641-6. Lo YM et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989;2:1363-5. Tutschek B et al. Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation: molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy. Prenat Diagn 1995;15:951-60

  47. Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) ONCOLOGIA La PCR ha rivoluzionato lo studio dei tumori: permette la detenzione di mutazioni in oncogeni associati al tumore (K-ras, N-ras….), geni soppressori del tumore (p53, p16), traslocazione cromosomiale (cromosoma Filadelfia, t(14;18) in LMC. Sarkar FH et al. A universal method for the mutational analysis of K-ras and p53 gene in non–small-cell lung cancer using formalin-fixed paraffin embedded tissues. Diagn Mol Pathol 1995;4:266-73. Stenmark-Askmalm M et al. Cellular accumulation of p53 protein: an independent prognostic factor in stage II breast cancer. Eur J Cancer 1994;30A:175-80. Shahnavaz SA et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol 2000; 190:417-22. Liu L et al. Mutation of the CDKN2A 5´ UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet 1999;21:128-32. Baker SJ et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 1989;244:217-21.

  48. Tecniche per identificare materiale genetico

  49. Target e metodo diagnostico

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