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DNA 時代. 基礎的分子生物學. 基因診斷操作的對象為基因或其片段 。 基因 是遺傳學上的一個概念， 是表現 一定功能的基本單位 。 基因 的物質基礎是脫氧核糖核酸（ DNA ）（有些病毒的基因是核糖核酸， RNA ）。 原 核細胞（如細菌和病毒）的基因單位較小，其排布一般是連續的 。 真 核細胞的基因一般較大，其排布是不連續的 ，被 稱為插入序列的部分所分隔 。. DNA 及 RNA 的化學 組成. DNA 和 RNA 統稱為核酸 ， 1868 年瑞士 年輕醫生米歇爾發現，在真核細胞中， 98% 以上的 DNA 存在於細胞核，少量的 DNA 分佈在線粒體中 。
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基礎的分子生物學 • 基因診斷操作的對象為基因或其片段。 • 基因是遺傳學上的一個概念，是表現一定功能的基本單位。 • 基因的物質基礎是脫氧核糖核酸（DNA）（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA）。 • 原核細胞（如細菌和病毒）的基因單位較小，其排布一般是連續的。 • 真核細胞的基因一般較大，其排布是不連續的，被稱為插入序列的部分所分隔。
DNA及RNA的化學組成 • DNA和RNA統稱為核酸， • 1868年瑞士年輕醫生米歇爾發現，在真核細胞中，98%以上的DNA存在於細胞核，少量的DNA分佈在線粒體中。 • RNA主要存在於細胞質中，佔其總量的90%左右。細胞外液則無核酸存在。對於非細胞形態的病毒來說，或含有DNA，或只含有RNA，因此可按所含核酸類型的不同，將病毒分為DNA病毒與RNA病毒。 • 組成核酸的基本單位是單核甘酸，所以核酸又稱為多核甘酸。 • 單核甘酸是由磷酸、戊糖及鹼基組成。如果戊糖是脫過氧的，則形成的單核甘酸為脫氧單核甘酸。 • 單核甘酸相互縮合形成RNA，脫氧單核甘酸相互縮合形成DNA。
DNA鹼基組成規律 (Chargaff規則) • 1．所有DNA分子中，嘌呤鹼總摩爾數等於嘧啶鹼總摩爾數，即A+G=T+C，並且以摩爾為單位，A=T、G=C。 • 2．DNA的鹼基組成具有種屬的特異性，即不同生物種屬的DNA具有各自獨特的鹼基組成。 • 3．DNA的鹼基組成沒有組織、器官的特性，即同種生物中不同組織及器官的DNA在鹼基組成上是一致的。 • 4．生物體內DNA的鹼基組成不受年齡、營養狀態和環境的改變之影響。在所有DNA分子中A=T、G=C這規律的發現，為DNA雙螺旋結構模型的建立提供了重要的依據。
DNA的結構 • DNA的一級結構：DNA是由四種脫氧核糖核酸通過3′.5′——磷酸二酯鍵彼此連接而成的線形或環狀大分子。 • DNA的二級結構：雙螺旋結構，DNA分子由兩條走向相反（一條5′→3′，另一條3′→5′）但互相平行的脫氧核糖核甘酸鏈組成，以一共同軸為中心，盤繞成雙螺旋結構。 • DNA的三級結構：DNA三級結構是雙螺旋鏈作進一步的扭曲構象。目前許多病毒DNA、線粒體DNA都是環型雙鏈DNA，而具有超螺旋結構。當超螺旋型DNA的一條鏈上出現缺口時，超螺旋結構被鬆開，可解旋形成開環型結構。DNA的三級結構與其結合的蛋白質有關。 • 人體每個細胞中長約1.7μm的DNA雙螺旋鏈，最終被壓縮8400多倍，分佈於各染色單體中。
RNA分子結構 • RNA類型：(細胞內含有三類主要的RNA) • 1．rRNA（核蛋白體RNA） ：是核蛋白體的組成部分，含量最多，約占細胞內全部RNA的74~80%，是蛋白質生物合成的「裝配機」。 • 2．tRNA （轉運RNA） ：佔細胞內RNA總量的10~25%，分散於胞液中。 tRNA的生理功能是運輸活化了的氨基酸，參與蛋白質的生物合成。 • 3．mRNA（信使RNA） ：佔細胞內RNA總量的2~5%，其代謝活躍，更新迅速，所以半衰期較短。細胞內mRNA的種類很多，但每種mRNA的含量卻很少，它是蛋白質生物合成的直接模板。
RNA分子結構 • RNA結構也不像DNA那樣整個分子都是雙螺旋結構，只有局部呈雙螺旋結構。 • 除少數病毒外，RNA分子均為單鏈結構。 • 與DNA相似，核甘酸通過3′.5′—磷酸二酯鍵連接而成多核甘酸鏈。 • 單鏈結構的RNA，在局部區域由於自身回折也可盤曲形成雙螺旋結構。 • 雙鏈部位的鹼基一般也彼此通過氫鍵而互相配對，即A-U，G-C。有些不參加配對的鹼基往往被排斥在雙鏈外，形成環狀突起。在不同的RNA分子中，雙螺旋區所佔比例也不相同。
核酸的理化性質 • 核酸的分子大小與粘度:螺旋結構轉變為線團時，粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標。 • 核酸的紫外線吸收:吸收紫外線的共同特點是在260nm處為最大吸收值。可以鑒別核酸樣品作為雜質的蛋白質含量。 • 核酸的變性:溫度升高而引起的變性稱熱變性(Tm一般為70~85℃ )。溶液酸鹼度的改變而引起的變性稱酸鹼變性(pH4.0~11.0之間最穩定)。 • 核酸的回復性:緩慢冷卻時、濃度越大時則越易復性。 • 核酸的雜交:分子雜交的基礎是DNA的變性與互補，也可以雜交形成新的雙螺旋結構。(應用於產前診斷遺傳性疾病)
核酸探針的種類 • （一）DNA探針 • （二）cDNA探针 • （三）RNA探针 • （四）寡核甘酸探針
核酸探針的種類（一）DNA探針 • DNA探針是最常用的核酸探針，長度在幾百鹼基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。 • 現已獲的DNA探針種類有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。 • 這些DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴於分子複製技術的發展和應用。以細菌為例，目前分子雜交技術用於細菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準確的多，是細菌分類學的一個發展方向。 • DNA探針（包括cDNA探針）有三大優點： 第一：這類探針多複製在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。 第二： DNA探針不易降解（相對RNA而言），能有效抑制DNA酶活性。 第三： DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標記法等，能用於同位素和非同位素標記。
核酸探針的種類（二）cDNA探针 • cDNA是指互補於mRNA的DNA分子（complementary DNA）。 • cDNA是由RNA經一種稱為逆轉錄酶的DNA聚合酶催化產生。攜帶逆轉錄酶的病毒侵入宿主細胞後，病毒RNA在逆轉錄酶的催化下轉化成雙鏈cDNA，並進而整合入宿主細胞染色體DNA分子，隨宿主細胞DNA複製同時複製，這種整合的病毒基因組稱為原病毒。 • 在靜止狀態下，可被複製多代，但不被表達，故無毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量複製。如其帶有癌基因，還可能誘發細胞癌變。 • 逆轉錄現在已成為一項重要的分子生物學技術，廣泛用於基因的複製和表達。從逆轉錄病毒中提取的逆轉錄酶也已商品化。 • 最常用的有AMV逆轉錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺甘酸尾，可以合成一段寡聚胸甘酸用作引物，在逆轉錄酶催化下合成互補於mRNA的cDNA鏈，然後再用RNaseH將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉錄過程。
核酸探針的種類（二）cDNA探针 • 所得到的雙鏈cDNA分子經S1核酸酶切平兩端後接一個有限制酶切點的接頭(Adapter) ，再經特定限制酶消化產生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。 • 常用的複製載體是λ噬菌體DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。 • 用這類載體可以得到包含105以上轉化子文庫，再經篩選方法篩選特定基因複製。用這種技術獲得的DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用於基因表達的檢測。
核酸探針的種類（三）RNA探针 • RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由於RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高。 • 這類RNA探針主要用於研究目的。例如在篩選逆轉錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA複製時，因無DNA探針可利用，獲得HIV的全套標記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA複製。 • 單向和雙向體外轉錄系統主要基於一類新型載體PSP和PGEM，這類載體在多複製位點兩側分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進行RNA轉錄。 • 如果在多複製位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以以DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。 • RNA探針和cDNA探針具有DNA探針所不能比擬的高雜交效率，但RNA探針也存在易於降解和標記方法複雜等缺點。
核酸探針的種類（四）寡核甘酸探針 • 在DNA序列未知而必須首先進行複製以便繪製酶譜和測序時，也常應用複製探針。 • 複製探針一般較寡核甘酸探針的特異性強，複雜度也高，從統計學角度而言，較長的序列隨機碰撞互補序列的機會較短序列少。 • 複製探針的另一優點是，可獲得較強的雜交信號，因為複製探針較寡核甘酸探針摻入的可檢測標記基因更多。 • 較長的探針對於靶序列變異的識別能力又有所降低。對於僅是單個鹼基或少數鹼基不配的兩個序列，複製探針不能區分。 • 複製探針優點是當用於檢測病原微生物時，不會因病毒或細菌DNA的少許變異而漏診，缺點則是不能用於檢測突變點。這種情況，通常要採用化學合成的寡核甘酸探針。
核酸探針的種類（四）寡核甘酸探針 • 合成的寡核甘酸探針具有以下特點： • 第一：由於鏈短，其序列複雜度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比複製探針短。 • 第二：寡核甘酸探針可識別靶序列內一個鹼基的變化，因為短探針中鹼基錯配能大幅度降低雜交體的Tm值。 • 第三：一次可大量合成寡核甘酸探針，使得這種探針價格低廉，與複製探針一樣，寡核甘酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。 • 最常用的寡核甘酸探針長18—40個鹼基，目前的合成可有效地合成至少50個鹼基的探針。
核酸探針的種類（四）寡核甘酸探針 • 對於合成的寡核甘酸探針有以下要求： • （1）長度以18-50鹼基為宜，較長探針雜交時間較長，合成量也低；較短探針特異性較差。 • （2）鹼基成分：G+C含量為40%-60%，超出此範圍則會增加非特異雜交。 • （3）探針分子內不應存在互補區，否則會出現抑制探針雜交的「髮夾」狀結構。 • （4）避免單一鹼基的重複出現。 • （5）一旦選定某一序列符合上述標準，最好將該序列與核酸庫中的核酸序列比較，探針序列應與靶序列核酸雜交，而與非靶區域的同源性不應超過70%或有連續8個或更多的鹼基的同源。否則，該探針不能用。
