Affidabilita` di un’analisi. Specificita`:

1. Affidabilita` di un’analisi. • Specificita`: • esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota) • controllo additivita` degli effetti interferenti • Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria) • al valore vero (media della popolazione). • L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso: • - metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard. • - metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero • Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme • al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici: • deviazione standard • CV%=s/quantita` *100 • La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi • Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita. • concetti collegati sono: • - rapporto segnale/rumore (S/N) • - minima quantita` rivelabile (LOD) • - minima differenza rivelabile

2. Standardizzazione e Calibrazione Metodi Assoluti. Sono metodi basati su una reazione chimica nota che va a completezza. Peso: gravimetria; elettrogravimetria; trmogravimetria Volume: titrimetria; gasometria Carica tot: coulombometria Metodi Comparativi Sono quei metodi analitici che richiedono una calibrazione con standard noti al fine di ottenere risultati accurati.

3. La calibrazione consiste nel determinare la relazione tra la Grandezza misurata (y) e la concentrazione dell’analita (C) y = f(C) y = mC [+b] y = m log(C) La calibrazione richiede la disponibilita` di standard primari. Nei metodi classici di analisi si usano standard primari e secondari.

4. Funzioni di calibrazione lineari y = mC + b y=parametro misurato C=concentrazione m=costante di proporzionalita` b=termine costante (es. valore del bianco, errore determinato) ERRORE DETERMINATO - errore misurabile e definito di cui si puo` tenere conto durante l’analisi. ERRORE INDETERMINATO - errore che deriva dall’incertezza delle misure. E` incongnito e non puo` essere controllato dall’analista. Produce una dispersione dei risultati di misure ripetute che puo` essere valutata solo tramite test statistici. Poiche` i punti di una calibrazione non cadono mai precisamente su una retta, si cerca la retta migliore col metodo della regressione lineare basata sul metodo dei minimi quadrati.

5. Presupposti del Metodo dei minimi quadrati: • le variabili indipendente (C) e dipendente (y) sono legate da una relazione lineare; • non vi sono errori associati ai valori noti di C degli standard. Tutto l’errore sta nella misura di y; • non vi sono dati che cadono fuori dal pattern statistico di distribuzione normale.

6. Coefficiente di correlazione (Pearson):

7. Grafici di calibrazione non lineari quando vi sono deviazioni dalla linearita` si puo` operare in modo da: 1) trasformare una o entrambe le variabili (indip. e dipend.) e rendere la relazione tra le due di nuovo lineare 2) ricorrere alla regressione nonlineare svantaggi legati al punto 2): maggiore complessita` del metodo; errori maggiori legati alla procedura; necessaria buona conoscenza del metodo e dell’algoritmo applicato

9. Non potendo eliminare o tenere esattamente conto di tutte le interferenze dovute alla matrice, • la calibrazione viene svolta in presenza della matrice stessa. • Presupposti: • relazione lineare tra parametro misurato (y) e concentrazione (C) dell’analita (y=mC) • il metodo analitico non deve avere metodo determinato. • Se la relazione e` del tipo y=mC+b, m deve essere nota. • la matrice non deve contenere specie che rispondolo come l’analita (ma con m in genere • differente). • AGGIUNTA DI STANDARD SINGOLA • se = misura prima dell’aggiunta • = conc. incognita dell’analita • = conc. dello standard nella soluzione dopo aggiunta • = misura dopo aggiunta • si ha • si ricava • se le variazioni di volume non sono significative Metodi di aggiunta standard

10. volendo tener conto anche del volume dello standard aggiunto: SVANTAGGI: - nessun controllo su eventuali errori commessi durante la misura o l’aggiunta - nessuna media che “abbatta” gli errori indeterminati - nessun modo di rivelare agenti interferenti o mascheranti

11. METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD si eseguono n aggiunte di standard contenente l’analita. dopo ogni aggiunta si ha (transcurando le variazioni di volume): si riarrangia in per si ricava volendo tener conto della diluizione, si ha: da cui riarrangiando

12. METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD • VANTAGGI: • l’errore indeterminato viene mediato dall’interpolazione grafica (regressione) • e` spesso possibile rivelare errori dovuti all’operatore (es. discontinuita` della retta) • e` spesso possibile identificare la presenza di interferenti e/o effetto matrice • permette una determinazione quantitativa senza conoscere la matura della matrice • SVANTAGGI: • e` un metodo di estrapolazione e quindi meno preciso di quelli per interpolazione (regressione) • ogni determinazione richiede la ripreparazione degli standard e la costruzione della curva di calibrazione

13. Le aggiunte sono in genere tutte uguali e il loro numero dipende da: - estensione del campo di linearita` - precisione richiesta La quantita` aggiunta e` solitamente dello stesso ordine di grandezza di quella del campione. CONFRONTO TRA PROCEDURE DI CALIBRAZIONE. curva di calibrazione (validita` limitata all’immediata determinazione) (influenza dell’effetto matrice) Metodo dello Standard Interno Metodo delle Aggiunte Standard

14. I metodidicostruzionedellacurvadicalibrazione e diaggiunta standard presuppongono: • precisaconoscenzadeivolumidicampione e di standard • costanza e ripetibilita`deifattoricheinfluenzano la misura • Poiche` per alcunetecnicheanalitichequesto non e` semprevero • (vedistabilita` nel tempo del detector), nasce la necessita` diconfrontare la misura con • quellafornitadauno standard internoaggiuntosiaagli standard dellacalibrazione, sia • al campionedaanalizzare. • Conseguenze: la variabilita` deifattoricheinfluenzano la misurasiesplicitanosiasull’analita • siasullo standard interno e ilrapportodellelororispostesimantienecostante • (a parita` diconcentrazione): maggioraffidabilita` analitica e duratadellacurvadicalibrazione. Metodi dello Standard Interno

15. consideriamo • come l’equazionecheesprime la rispostastrumentale ad unacertaconcentrazionedi due • compostichimicidiversi 1 e 2. Si avra` quindi: • analita • st. interno • se e derivanodallastessaanalisi, si ha e • FATTORE DI RISPOSTA • da cui: • METODO DELLO STANDARD INTERNO SINGOLO: • sideterminailvaloredi R daun’analisifattasu un campione (+standard) noto • siaggiungeunaquantita` nota di standard al campione e sidetermina:

16. METODO DELLO STANDARD INTERNO MULTIPLO: • si ripete la misura su soluzioni contenenti conc. variabili di analita • e conc. costante di standard interno • Il METODO DELLO STANDARD INTERNO puo` essere applicato attraverso: • l’uso dei fattori di risposta: • partendo da un campione incognito, si prepara un campione in cui l’analita e` presente in • quantita` incognita x e lo standard interno e` presente in quantita` nota z • l’uso della retta di calibrazione: • si preparano vari campioni contenenti quantita` note di analita e la stessa quantita` di standard interno

17. CONFRONTO FRA METODO DELLO ST. INTERNO SINGOLO E MULTIPLO: • tempi di analisi: il metodo dello st. singolo e` molto piu` rapido: una volta determinato R basta • una sola misura, anche per piu` analiti (di cui sia noto il rispettivo R) in simultanea • affidabilita` dei risultati: il metodo dello st. singolo e` meno affidabile perche` basato su una singola • misura che puo` contenere errori casuali gravi, non mediati • importanza della linearita`: nel caso dello st. singolo R e` assunto rigorosamente costante, mentre • con lo st. multiplo si costruisce una curva di calibrazione che potrebbe anche non essere lineare. • Le condizioni necessarie per poter applicare questi metodi sono: • disporre di uno st. interno molto simile all’analita (chimicamente oppure in funzione della tecnica di analisi) • lavorare all’interno del range operativo lineare • - se si utilizza un metodo di trattamento del campione e` necessario conoscere i recuperi relativi • per l’analita e lo st. interno e correggere quindi le concentrazioni per tali fattori. maggiore accuratezza e precisione (~0.5%) rispetto ad altre procedure di calibrazione (~1-2%) • SCELTA DELLO STANDARD INTERNO: • un buon St. Interno deve essere: • omologo all’analita (proprieta` chimiche e fisiche simili) • separabile dall’analita e dagli altri componenti del campione • non presente nel campione originale • non deve dare reazioni chimiche o altre interferenze col campione • miscibile col solvente impiegato per l’analisi

18. METODO DELLA NORMALIZZAZIONE INTERNA: Non e` previsto confronto con alcun standard. La somma delle aree dei picchi (es. analisi cromatogr.) e` posta = 100 e le aree dei singoli picchi sono riportate come % CASO 1: la risposta del rivelatore e` la stessa per tutti i campioni. In questo caso la conc. % dei componenti = AREA% CASO 2: i componenti danno risposte diverse. Si devono determinare i fattori di correzione o fattori di risposta da un cromatogramma di composizione nota. I fattori di correzione possono anche essere non assoluti ma relativi a quello di un componente, posto = 1. Requisiti. tutti i componenti devono essere: - presenti e visibili nel cromatogramma - disponibili e reperibili per poter determinare il fattore di risposta

19. Affidabilita` di un’analisi. • Specificita`: • esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota) • controllo additivita` degli effetti interferenti • Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria) • al valore vero (media della popolazione). • L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso: • - metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard. • - metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero • Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme • al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici: • deviazione standard • CV%=s/quantita` *100 • La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi • Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita. • concetti collegati sono: • - rapporto segnale/rumore (S/N) • - minima quantita` rivelabile (LOD) • - minima differenza rivelabile

20. METODO DEL RECUPERO: • Il recupero si valuta misurando concentrazioni di analita aggiunte a campioni reali (campioni spiked). • Recupero(%) = [( C1 - C2 ) / C3 ]·100 • dove: • C1: concentrazione dell'analita misurata dopo l'aggiunta • C2: concentrazione dell'analita misurata prima dell'aggiunta • C3: concentrazione aggiunta • Tanto più il recupero è prossimo al 100% tanto il risultato è buono sebbene un recupero del 100% non indichi necessariamente l'assenza di errori. Il risultato finale dell'analisi può essere espresso tenendo conto della correzione apportata in funzione del recupero. È possibile ottenere anche valori superiori al 100%. • Solitamente un metodo analitico prescrive che si debba rientrare entro un ben definito intervallo di valori di recupero.

21. CONFRONTO FRA TECNICHE ANALITICHE. (validazione di metodi) relazione lineare tra le misure effettuate con due tecniche indipendenti avente pendenza = 1

22. RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N)

23. RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N) e LIMITE DI RIVELABILITA` (LOD) LOD e` definito come: se non e` presente un bianco da analizzare si puo` utilizzare la dev. st. della regressione

24. questo e` il metodo piu` preciso per determinare LOD perche` utilizza insieme retta di regressione e concetti di statistica