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酶活性浓度测定的 主要影响因素及控制

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酶活性浓度测定的 主要影响因素及控制. 广州医学院医学检验系 临床生化教研室. 酶( enzyme ). 酶的应用 临床诊断酶学产生至今已有 100 年的历史。 用于诊断的酶类已超过 100 多种,常用的数十种。 酶测定约占目前临床化学总工作量的 1/4 到 1/2 。 酶的概念 是一种由活细胞产生,具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质,又称为 生物催化剂。 酶的测定方法分为绝对定量法和 相对定量法 两大类,以后者为主。 酶催化化学反应的能力称为 酶活性 ( activity )。 酶活性浓度的测定受许多因素的影响 。. 酶活性浓度测定的主要影响因素.

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酶活性浓度测定的主要影响因素及控制

广州医学院医学检验系

临床生化教研室

enzyme
酶(enzyme)
  • 酶的应用
    • 临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。
    • 用于诊断的酶类已超过100多种,常用的数十种。
    • 酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。
  • 酶的概念
    • 是一种由活细胞产生,具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质,又称为生物催化剂。
    • 酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类,以后者为主。
    • 酶催化化学反应的能力称为酶活性(activity)。
    • 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。
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酶活性浓度测定的主要影响因素
  • 1. 标本及标本采集和处理因素
  • 2. 试剂及方法学因素
  • 3. 仪器因素的影响
  • 4. 测定条件与参数设置
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1.标本及采集和处理的影响因素
  • 1.1 溶血
  • 1.2 抗凝剂
  • 1.3 温度
  • 1.4 空气与光线
  • 1.5 标本副反应
  • 1.6 酶蛋白浓度
  • 1.7 其他
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1.1 溶血
  • 最重要的影响是RBC内酶的大量释出。
    • 大部分酶在细胞内外浓度差异明显,且其活性远高于血清;
    • 如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高100、15和7倍左右。
  • RBC释放的Hb在300~500nm可见光波段能使吸光度值明显升高,干扰分光光度计的测定。
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1.1 溶血影响的控制
  • 减少溶血
    • 体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加以克服;
    • 分清体内溶血与体外溶血。
  • 减少溶血的干扰
    • 可通过设置样品对照,或使用双波长比色、连续监测法以及改进商品试剂等措施,克服对分光光度分析的影响。
    • 应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。
1 1 rbc
1.1 注意: RBC中酶的干扰
  • 不仅表现在溶血影响上,采血后如不及时将血清和血凝块分离,血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清,
  • 所以,静脉采血后,必须在1~2h内及时离心,将血清与血细胞、血凝块分离,以免引起误差。
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1.2 抗凝剂
  • 临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶,一般都应以血清作为首选测定标本。
  • 大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性,
    • EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂,它们为金属离子螯合剂;
    • 在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子,Ca2+是AMY的激活剂,Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶(5′-NA)的激活剂。
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1.2 肝素
  • 是一种粘多糖,
  • 是对酶活性影响最小的抗凝剂,
  • 对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响,
  • 适于急诊时迅速分离血浆进行测定。
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1.3 温度
  • 由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用,如无细菌污染,某些酶(如AST、-GT和ALP等)可在室温保存1~3天活性不受影响。
  • 有些酶极不稳定,如血清前列腺ACP,在37℃放置1h,活性可下降50%。
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1.3 温度影响的控制
  • 及时检测
  • 低温贮存
    • 大部分酶在低温中比较稳定,因此当天不能测定时,应在血清分离后置冰箱中冷藏。
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1.4 空气与光线
  • 血清置于空气中时,
    • 血中CO2丧失极快,pH可在15min内由7.4增至8.0,从而使对碱性环境敏感的ACP活性迅速下降。
  • 某些酶易受光线破坏,
    • CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆地失活,其失活程度与暴光时间的长短成正比。
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1.5 副反应
  • 副反应是指酶促反应体系中,除待测酶反应外,其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶测定的反应。
  • NAD(P)H是目前使用最多的指示反应物质。
    • 体内存在数以百计的氧化还原酶,它们的辅酶很多是一致的。
    • 若存在内源性代谢物,必然会相互干扰。
1 5 alt
1.5 副反应(酶偶联法测ALT)
  • 由于反应体系中含有大量NADH和LD,可与血液标本中所含丙酮酸反应,引起340nm波长处吸光度下降,从而引起ALT活性测定误差。
  • ALT活性测定的反应式如下:
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1.5 副反应的控制
  • 可通过加入副反应抑制剂,
  • 或对样品进行预处理等方法给予排除。
  • 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时间是最经济的方法。
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1.6 酶蛋白浓度
  • 酶蛋白在低浓度时易失活,可能是亚基易解离、易吸附于容器上和易发生表面变性之故。
  • 酶蛋白在高浓度时较稳定,但活性过高超过检测仪器的线性范围时,需将样品进行稀释或减少样品用量后再行测定。
  • 样品稀释后所测得的活性常偏高,可能与抑制剂被稀释有关。
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1.7 其他
  • 样本器皿的质地和洁净度,采血部位,以及血清中过量的胆红素、脂质,样品制备过程中的振摇等,均可引起酶活性改变。
  • 季节
    • 冬季气温低,血液凝固慢,血清分离时间延长,可引起血细胞内酶释至血清,加上血清与空气长时间接触,可使某些抑制剂遭到破坏,故冬季测定LD的活性较夏季高。
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2. 试剂及方法学的影响因素
  • 酶的测定大多使用商品试剂盒
    • 不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方(包括缓冲液、底物、添加剂等)、产品质量、技术含量等常有区别。
  • 常见的影响因素
    • 2.1定时法与连续监测法
    • 2.2 检测底物或检测产物
    • 2.3 底物启动模式与样品启动模式
    • 2.4 正向反应与逆向反应
    • 2.5 试剂的干扰作用
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2. 影响因素的控制
  • 选购试剂盒时
    • 要仔细阅读试剂盒说明书;
    • 了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等;
    • 选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方法,或选择公认的测定方法。
  • 使用时
    • 定期对试剂盒的质量进行监测;
    • 准确性、重复性、稳定性好,线性范围宽;
    • 正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。
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2.1 定时法与连续监测法的选用
  • 在条件许可的情况下,应尽可能全部采用连续监测法,少用或不用定时法。
    • 连续监测法可以选择线性期的反应速度来计算酶活性,测定结果可靠,是首选的方法。
    • 但该方法仪器要求相对较高。
  • 在基层单位,某些酶采用定时法测定也可以得到比较准确的结果。
    • ALP酶活性的测定,如加做样品空白,两法的结果准确性相当。
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2.1 连续监测法与定时法的酶促反应时间进程曲线
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2.2 检测底物或检测产物的选择
  • 取决于哪个更方便,测定的结果更准确。
  • 通常原则是选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。
    • 反应时底物浓度高,反应时间短;
    • 这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之一。
    • 除部分测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外,已很少采用测定底物消耗量的项目。
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2.2 检测底物或检测产物的选择
  • 底物与产物
  • 举例
    • ALT测定(赖氏法-定时法)

L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 α-丙酮酸+ L-谷氨酸

α-丙酮酸 + 2,4-二硝基苯肼 2,4-二硝基苯腙

    • (红棕色,λ=505nm)
    • ALT测定(连续监测法)

L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 α-丙酮酸+ L-谷氨酸

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2.3 底物启动模式与样品启动模式
  • 底物启动模式(IFCC推荐采用)。
    • 指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时间后,再加入内这种底物的试剂2,开始启动样品中的待测酶的酶促反应。
    • 好处是在待测酶酶促反应开始之前,可以除去某些干扰物,包括内源性干扰物和外源性干扰物。
    • 这种模式需要双试剂剂型。
  • 样品启动模式。
    • 指反应所需的试剂先混合在一起,然后加入样品,依靠样品中的待测酶来启动酶促反应;
    • 只是在延滞期去除部分干扰物。
    • 这种模式可采用单一试剂剂型。
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2.3 需要注意
  • 某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑,并没有将底物单独作为第二试剂,也起不到消除内源性干扰的作用。
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2.4 正向反应与逆向反应
  • 一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。
  • 除原则上选择对底物亲和力大,酶转换率高的方向外,还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。
  • 例如,
    • CK的测定普遍采用逆向反应,因其逆向反应是正向反应的6倍,而且受影响因素少。
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2.4 正向反应与逆向反应
  • LDH测定的选择目前尚有争议。
  • 国内多采用正向反应(L→P),与IFCC在2001年发表的操作手册一致。
    • 正向反应有利于LD1的活性表达,同时试剂成本低廉,稳定性好。
  • 国外常用方法曾是逆向反应(P→L),
    • 反应速度是正向的3倍,成本也较低。
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2.5 检测试剂的干扰作用
  • 试剂酶的污染。
    • 组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶,它将干扰各种还原酶的测定。
  • 底物的非酶反应。
    • 很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定,放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。
    • 如碱性磷酸酶(ALP)测定
  • 解决的方法
    • 是通过试剂空白管检出并加以校正。
    • 选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量好的试剂。
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3 仪器的影响因素
  • 加样系统
    • 加样的准确性、重复性和携带污染;
  • 反应系统
    • 反应杯的形状、表面和携带污染;
    • 反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围;
    • 搅拌和清洗机构的效果和携带污染;
  • 检测系统
    • 光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等均会造成结果的偏差。
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3 仪器影响因素的控制
  • 在日常工作中,除常规做好仪器和设备的正确使用和维护外,
  • 重点应注意仪器的校准问题。
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3.1 酶活性浓度的计算公式
  • 摩尔吸光系数  和系数 K 均为常数,
  •  和K受仪器诸多因素的影响,
    • 如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。
  •  和K 可用校准物定期校正。
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3.2 校准物
  • 可用作酶活性测定用的校准物分两类。
  • 一类是产物的基准物质,
    • 如对硝基酚、对硝基苯胺等,
    • 用于校准仪器的  值(摩尔吸光系数)。
  • 另一类称酶校准物(Enzyme calibrator),
    • 多是用人血清或动物血清作介质,与测定标本比较接近,
    • 用于校准仪器的 K 值(酶活性浓度定量系数)。
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3.2 校准物
  • 国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。
  • 各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。
  • 常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。
  • 目前,临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。
3 3 340 nm
3.3 ε的校准(340 nm波长)
  • NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。
  • 在340nm的NAD(P)H的,可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的。
  • NAD(P)H的ε为6220。
  • 如果6 000>ε>6600为不合格,则需找维修部检查。
  • 注:干涉滤光片者需校准,光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。
3 3 405 nm
3.3 ε的校准(405 nm波长)
  • 最常用的色素原为对硝基苯酚等。
  • 对硝基苯酚在405 nm的,可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂,对硝基苯酚标准液作为血清标本,实际测定计算ε值。
  • 对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大,则需找维修部检查。
3 4 k
3.4 K的校准(公式计算法)
  • 将上述实测ε值代入K值计算公式得到校准K值外。
3 4 k1
3.4 K的校准(酶校准物)
  • 使用公认的酶校准物对K值进行校准,它是国际上目前酶测定标准化新途径。
  • 使用酶校准物的优点,
    • 除具有实测ε值换算出的校准K值所具有的一切优点外,
    • 还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性,可使不同实验室之间的测定结果相对统一。
3 4 k2
3.4 K的校准(频率)
  • 最好(低)每半年进行一次酶活性的校准。
    • 仪器在使用过程中,滤光片、加样系统的精度都可能发生变化,光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等,都会导致测定结果的偏差。
  • 但日常工作中,遇到下列情况时,必须进行校准:
    • 试剂盒改变厂家,或者更换了批号;
    • 仪器性能改变,如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件;
    • 质控反映出异常的趋势或偏移,或者超出实验室规定的接受限,采取一般性纠正措施后,不能识别和纠正问题时。
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4.1 最适条件包括
  • ①合适的底物和最适底物浓度;
  • ②理想的缓冲液种类和最适离子强度;
  • ③反应液的最适pH;
  • ④最适反应温度;
  • ⑤合适的辅因子、激活剂浓度;
  • ⑥若是酶偶联反应,还需要确定指示酶和辅助酶的用量;
  • ⑦合理的测定时间,包括延滞期尽量短暂,有足够的线性期;
  • ⑧合适的样品与反应试剂的比例;
  • ⑨足够的检测范围;
  • ⑩尽量去除各种抑制剂等。
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4.2 反应温度
  • 目前常规实验室越来越多的使用37℃,这更多地是从实际工作方便来考虑。
  • 1986年以前,IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃,纯镓的熔点为29.77℃,镓作为此温度的基准物质,保证了测定仪器在30℃的高度准确性。
  • 2001年,IFCC正式发表了“37℃下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统”,包括CK、LD、ALT、AST、GGT五个酶在内。
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4.3 延滞期、线性期的确定
  • 延滞期的确定
    • 延滞期可以因酶在样品中所存在的介质不同而略有差别,原因可能是存在内源性干扰物,也可能存在一些抑制剂。
    • 确定原则是多观察浓度不等、病理情况不同的标本,选择延滞期最长者作为确定值。
  • 线性期的确定
    • 离不开酶浓度的可测上限,因为酶浓度越高,在同样时间内消耗底物越多,产生产物越多,底物的不足和产物的抑制将导致非线性期的提前到来。
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4.3 延滞期、线性期的确定
  • 线性期与非线性度的大小有关,没有绝对意义上的线性期,线性期是以指定的非线性度作为判断基础的。
  • 线性期如何确定呢?主要看读数次数和读数间隔来决定,为了计算非线性度,按最小二乘法的计算要求,读数次数应不少于4次,读数间隔按一般仪器要求30秒就足够了,线性期在2分钟以上即可。
  • 中华医学会检验学会规定酶活性测定要求线性期不短于2.5分钟。若规定线性期不短于2.5分钟可以测得酶活性的最高浓度就是该法的测定上限。
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4.4 样品与试剂比例
  • 根据酶活性计算公式不难看出,改变样品与反应液总量的比例就可以改变K值。
  • 样品量与反应液总量的比例与方法检测的灵敏度和检测上限有关,与测定误差也有关。
  • 按仪器噪音0.001计算,K值不易过大,否则会造成检测误差加大。
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4.4 样品与试剂比例
  • 值得注意
    • 酶活性的发挥与介质有关,经常发现改变样品与反应液总量的比例,测定结果并不会成正比例地改变,可能与激活剂、抑制剂、酶的解聚和聚合、酶的稳定性等因素有关。
  • 因此,
    • 样品与反应液总量的比例一旦选定,就不能随意更改。
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4.5 自动生物化学分析仪参数的设置
  • 常规参数
  • 包括方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、反应时间、孵育时间、延迟时间、监测时间、试剂吸光度上、下限、底物耗尽限额、线性度、试剂空白速率、线性范围、计算因子F值(或系数K)等。
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小结:保证结果准确可靠的条件
  • 控制好标本采集和保存等实验前影响因素;
  • 选择IFCC或中华医学会推荐的方法;
  • 按照IFCC推荐法所规定的配制方法生产试剂,并提供酶类校正物;
  • 做好室内质量控制,监控试剂质量和仪器性能;
  • 实验室的操作人员应控制好测定条件,合理编制分析仪参数;
  • 参加各地区组织的酶类室间质评工作,不断提升实验室的比对能力。
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小结:作好质量控制,保证检测质量
  • 做好室内质量控制,保证酶类检测结果的精密度;
  • 参加室间质量评价,保证酶类检测结果的准确度;
  • 检验工作的标准化,是促进检验质量提高的有效措施。
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